Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Přehled analytických metod II.. Metody atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry) molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR) chromatografie (GC, HPLC,

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Přehled analytických metod II.. Metody atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry) molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR) chromatografie (GC, HPLC,"— Transkript prezentace:

1 Přehled analytických metod II.

2 Metody atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry) molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR) chromatografie (GC, HPLC, TLC, CE) hmotnostní spektrometrie spojené techniky

3 Schéma spektrometrů emise absorpce fluorescence, rozptyl světla

4 Plamenová fotometrie plamen – monochromátor – fotoelektrický násobič – zpracování signálu plamen – odpaření roztoku, atomizace a excitace atomů (zářivou) deexcitací dochází k záření, jehož frekvence (vlnová délka) odpovídá rozdílu dvou energetických hladin elektronů záření prochází monochromátorem a dopadá na fotonásobič intenzita záření je závislá na množství analytu

5 Plamenová fotometrie princip plamenové emisní spektroskopie s použitím plamene o nízké teplotě (propan, butan, jejich směsi nebo zemní plyn) vlnové délky – Na nm, K nm, Ca nm.. kvantitativní analýza alkalických kovů a kovů alkalických zemin vhodné pro stanovení v potravinách, nápojích, hnojivech, půdě, při těžbě kovů, v chemickém, farmaceutickém, papírenském a olejářském průmyslu

6 Atomová emisní spektrometrie atomizace a excitace atomů – zářivá deexcitace působení vysokých energií čím složitější elektronový obal atomu, tím složitější spektrum (větší počet čar ve spektru) čáry neionizovaných atomů, iontů budící zdroj – záření (lasery), elektrická energie (oblouky, jiskry, výboje, plazmatron), chemické energie (plameny) disperzní systém (mřížka, hranol ) detekce – fotonásobič (historie – fotografická deska) kvantometry – rychlá multielementární analýza

7 Atomová absorpční spektrometrie výbojka s dutou katodou plamen zavádění aerosolu vzorku mřížkový monochromátor štěrbina FN dutá katoda – materiál ze stanovovaného kovu anoda – těžko tavitelný materiál (Zr, W..)

8 Atomová absorpční spektrometrie FotonásobičMonochromátor mřížka dutá zrcadla uspořádání Czerny-Turner

9 Co s kolísáním signálu a neatomovou absorpcí ? VDK-výbojka s dutou katodou, DV-deuteriová výbojka, PZ- polopropustná zrcadla, DZ-dutá zrcadla, MOD-modulátor (rotující clona), PL-plamen (nebo grafitová kyveta), VZ-aerosol vzorku, MON-mřížkový monochromátor, FN-fotoelektrický násobič

10 AAS - shrnutí atomizace (zmlženého) vzorku v plameni emise záření s charakteristickými spektrálními čárami pro stanovovaný prvek – z duté katody absorpce tohoto záření atomy analytu v plameni (nebo kyvetě) zbytek záření (neabsorbované) prochází na fotonásobič fotonásobič převede fotony na elektrony, zesílí signál a zaznamená proud

11 Molekulová spektrometrie Ultrafialová a viditelná oblast (200 – 380 – 800 nm) absorpcí záření určité vlnové délky dochází k excitaci valenčních elektronů zdroj – deuteriová výbojka (UV), wolframová žárovka disperzní systém (hranol, mřížka, filtr) kyveta (křemenná – UV, skleněná, plastová), průtočná detekce – fotonásobič jednopaprskové dvoupaprskové diodové pole

12 Využití UV/VIS spektrometrie kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru (charakteristické pro chromoforní skupiny v molekule), atlasy spekter, malé rozdíly – často doplňkové informace k dalším metodám) kvantitativní stanovení látek (kalibrace) Kalibrační graf - fenol y = x R 2 = koncentrace (mg/l) absorbance

13 Infračervená spektrometrie (IČ, IR) absorpce záření v oblasti (10 – 500 – 4000 – 10000) absorpce je spojená se změnou vibračních a rotačních stavů molekuly !! základní podmínka interakce IČ záření – musí docházet ke změně dipólového momentu během vibrace – HCl absorbuje, N 2 neabsorbuje, CO 2 ? kvalitativní analýza – poloha a intenzita pásů ve spektru ve spektru – valenční vibrace – vzdálenost jader - deformační vibrace – valenční úhly

14 IČ instrumentace zdroj záření – tuhé zářiče z polovodičových materiálů (globar – SiC, Nernstova tyčinka oxidy zirkonia a yttria) disperzní systém (několik mřížek, interferometr FT-IR) kyvety – pro kapaliny a plyny (materiál KBr, NaCl) pevné vzorky – tablety s KBr, nujolová suspenze (nasyc uhlovodíky –C 20 - C 30 ), reflexní spektra detekce - termoelektrický článek zpracování signálu (odečet absorbance, v případě FT – matem. transformace, porovnání s databází)

15 IČ spektrum C-halogen, mimorovinné deformační C-H oblast otisku prstu (C-C, C-N, C-O) valenční vibrace Y-H, násobné vazby

16 Příklady IČ vibrací Typ vibraceSkupinaVlnočetIntenzita - OH silná - OH s H-vazbou silná (širší) as - NH střední s - NH střední as - CH silná -C=O *silná  (rov) - NH střední-silná -C-Cl silná -C-Br silná  (mimorov) p- R 1 -benz.-R silná  (mimorov) o- R 1 -benz.-R silná

17 IČ spektrum

18 Nukleární magnetická rezonance (NMR) měřená látka je umístěna v silném magnetickém poli musí být přítomna jádra s nenulovým jaderným magnetickým momentem se absorpcí radiofrekvenčního záření dojde ke změně orientace magnetického momentu jádra – do vyšších energetických stavů (E 1  E 2 ) precesní pohyb Larmorova frekvence  gyromag. poměr jádra do základní stavu přechází relaxačními procesy

19 NMR - instrumentace magnet (supravodivý) – a - póly, b - přídavné cívky pro změnu B vysokofrekvenční vysílač (elektromagnetické pole je orientováno kolmo na osu vnějšího pole magnetického) - c sonda – kyveta se vzorkem - e přijímač – indukční cívka - e zpracování signálu (pulsní techniky – Fourierova transformace) e, f, g – registrační část k – kontrolní oscilokop

20 NMR – chemický posun elektrony v okolí jádra ovlivňují velikost magnetické indukce v místě jádra  chemický posun  v M – frekvence měřeného pásu v ST – rezonanční frekvence standardu (TMS)

21 Spin – spinová interakce a integrální intenzita signálu A – důvod rozštěpení methylového píku - sousední methylenové protony         1:3:3:1 B – důvod rozštěpení methylenového píku - sousední methylenové protony     1:2:1 integrální intenzita signálu: odpovídá počtu protonů

22 NMR - aplikace 1 H-NMR, 13 C-NMR, 19 F-NMR strukturní analýza – spolu s MS nejsilnější nástroj vůbec !!! kvantitativní analýza studium rotace skupin v molekule, vodíkových vazeb

23 Separační techniky klasické techniky – destilace, extrakce, filtrace, centrifugace.. Chromatografie dělení podle mobilní fáze plyn – plynová chromatografie (GC) kapalina – kapalinová chromatografie (HPLC, TLC) Elektromigrační techniky kapilární elektroforéza, isoelektrické fokusace...

24 Chromatografie

25 Plynová chromatografie 1-tlaková láhev (nebo generátor plynu), 2-regulace tlaku, 3-regulace průtoku, 4-dávkovací zařízení, 5-detektor, 6-termostat, 7-kolona, 8-zesilovač, 9,10-počítač

26 Plynová chromatografie nosný plyn – N 2, H 2, He, Ar dávkování vzorku – vyhřívaná nástřiková hlava plynové vzorky (  l) kapalné vzorky (1-100  l) pevné vzorky (příprava roztoků) split/splitless: nosný plyn kolona odpad

27 Plynová chromatografie kolony dnes prakticky výhradně kapilární kolony (průměr 0,1 – 0,5 mm, délka 10 – 100 m) sorbenty – silikagel, aktivní uhlí, molekulová síta, porézní polymery kapalné stacionární fáze – Carbowax (polyethylenglykol), polysiloxany, polyestery

28 Plynová chromatografie detektory - tepelně vodivostní detektor plamenový ionizační detektor nedestruktivní, méně citlivý, univerzální destruktivní, citlivý selektivní - uhlovodíky

29 Plynová chromatografie detektory - detektor elektronového záchytu nedestruktivní, citlivý, selektivní – halogenderiváty, nitrolátky - hmotnostní spektrometr – vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý

30 Plynová chromatografie -analýza těkavých látek -netěkavé látky – derivatizace, pyrolýza -vysoká účinnost -identifikace - retenční data -kvantifikace – plocha (výška) píku -výhodná kombinace s MS 1. 2-chlorbifenyl, 2. 4-chlorbifenyl, 3. 2,2'-dichlorbifenyl, 4. 2,4-dichlorbifenyl, 5. 4,4'-dichlorbifenyl, 6. 3,5,3'-trichlorbifenyl, 7. 2,4,4'-trichlobifenyl, 8. 2,5,2',5'-tetrachlorbifenyl, 9. 2,4,6,4'-tetrachlorbifenyl, 10. 3,4,4'- trichlorbifenyl, 11. 2,3,4,6,2'-pentachlorbifenyl, 12. 2,3,4,4'-tetrachlorbifenyl, 13. 2,3,4,5,2'-pentachlorbifenyl, 14. 2,4,5,2',4',5'-hexachlorbifenyl, 15. 2,3,4,2',4',5'- hexachlorbifenyl, 16. 2,3,4,5,2',3'-hexachlorbifenyl GC analýza PCB

31 Kapalinová chromatografie 1,2 – zásobníky mobilní fáze 3 – programování gradientu 4 – směšovač 5 – odplyňovač 6 – vysokotlaké čerpadlo 7 – tlumič tlakových pulsů 8 – trojcestný ventil 9 – saturační předkolona 10 – dávkovací zařízení 11 – kolona 12 – detektor 13 – jímač frakcí 14 – zesilovač 15, 16 – vyhodnocování - počítač

32 Vysokotlaká čerpadla 1.Elektromotor s krokovým motorem 2.Převodovka 3.Závit na táhle pístu 4.Píst 5.Válec naplněný MF 6.Ke koloně 7.Ventil umožňující plnění čerpadla MF 8.Zásobník MF velkoobjemová stříkačka pístová čerpadla – malý objem činné části 1.Elektromotor 2.Převodový mechanismus 3.Píst 4.Pracovní prostor válce 5.Výtlačný ventil 6.Nasávací ventil 7.Ke koloně 8.Zásobník mobilní fáze 9.Těsnění pístu

33 Dávkovací ventily Schéma dávkování b) vnitřní dutina a) smyčka

34 Kolony Ovlivňování účinnosti homogenní a rovnoměrné plnění kolony sorbentem použití náplní s tenkou aktivní vrstvou na povrchu zmenšování částeček sorbentu monolity A – pórovitý silikagel (>25  m) B – povrch film stac. fáze C –povrchová pórovitost D – mikropartikulární náplně (  m) Typy stacionární fáze chemická modifikace silikagelu - sorbenty C-18, C-8 (reverzní fáze), C-2 polymerní sorbenty (inertnost, menší mechanická stabilita) iontoměniče afinitní chromatografie

35 Detektory Typy detektorů Spektrofotometrický (UV-VIS)– absorpce záření Refraktometrický- index lomu Fluorescenční- fluorescence Elektrochemický- potenciál, proud Vodivostní- vodivost Light scattering- rozptyl světla Spojení s MS (MS n ), IČ, NMR

36 Spektrofotometrický detektor 1–zdroj UV záření, 2-měrná cela, 3-referentní cela, 4 – fotočlánky, 5-optický systém detektoru, 6-přítok a odtok MF z kolony, 7-čistá MF

37 Detektor diodového pole

38 Fluorescenční detektor 1-excitační zář.; 2-emisní fluorescenční zář.; 3-křemenná cela; 4-štěrbina; 5-maska s počerněným povrchem; 6-konkávní zrcadla 7-fotonásobič Schéma fluorimetrického detektoru nutnost derivatizovat (nebo fluoreskující látky) nutnost derivatizovat (nebo fluoreskující látky) vyšší cena detektoru vyšší cena detektoru vysoká citlivost vysoká citlivost

39 Vodivostní detektor Principem je měření vodivosti během HPLC analýzy. Průchod vodivých analytů způsobí změnu vodivosti. malý objem detekční cely (dvouelektrodové uspořádání) často v bezkontaktním provedení nejvíce využíván tam kde se analyzují ionty: iontoměničová chromatografie ion párová chromatografie kapilární elektroforéza

40 Spojení s hmotnostní spektrometrií Proč spojení HPLC/MS – co obě metody nabízí ? HPLC je základní technika pro separaci netěkavých látek (od malých molekul léčiv až po proteiny)HPLC je základní technika pro separaci netěkavých látek (od malých molekul léčiv až po proteiny) hmotnostní spektrometr poskytuje informace pro identifikaci (molekulová hmotnost, struktura) při zachování ostatních vlastností detektoru (kvantifikace, sledování čistoty vzorku)hmotnostní spektrometr poskytuje informace pro identifikaci (molekulová hmotnost, struktura) při zachování ostatních vlastností detektoru (kvantifikace, sledování čistoty vzorku) umožňuje analyzovat látky bez chromoforuumožňuje analyzovat látky bez chromoforu další rozměr selektivity separace (SIM, MS-MS pro izobarické látky)další rozměr selektivity separace (SIM, MS-MS pro izobarické látky)

41 Chromatogram Základní parametr chromatografie - Rozlišení Analyticky významné parametry -identifikace – retenční časy -kvantifikace – plocha pod píkem – výška píku

42 Kapilární elektroforéza F e ………….. elektrická síla F f ………….. odporová síla F e =z i.e.E F f =k.h.v i pro kulové ionty k=6. .r i Pro rovnost obou sil: z i.e.E = 6.  r i.v i FeFe FfFf vivi

43 Kapilární elektroforéza

44 Elektroosmotický tok Sternova vrstva (pevná) difuzní vrstva -SiOH  –SiO - + H + (pKa  6) Stěna kapiláry s disociovanými skupinami A1A1 inj detEOF A2A2 N K2K2 K1K1 +-

45 Detekce používají se kapiláry o velmi malém průměru (snadná disipace Jouleova ohřevu, kapilární síly převládají nad gravitací) 365 um 75 um

46 Detekce UV/VIS – adaptované cely z kapalinové chromatografie LIF – laserem indukovaná fluorescence spojení s ESI-MS

47 Využití kapilární elektroforézy vysoká účinnost pružnost při optimalizaci selektivity tolerance ke složitým matricím rychlost (high throughput) klinické a biochemické aplikace farmacie (  problémy s QC) životní prostředí průmysl

48 Hmotnostní spektrometrie ovlivňování pohybu iontů ve vakuu působením elektrického a magnetického pole určení poměru hmotnosti ku náboji měření intenzity iontů hmotnostní spektrum určení molekulové hmotnosti přítomnost a poměr izotopů přesné měření m/z – elementární složení iontu fragmentace iontů – informace o struktuře látky nejúčinnější identifikační nástroj v analytické chemii

49 Hmotnostní spektrometrie m/z=94  m/z=28

50 Hmotnostní spektrometrie izotop chloru molekulární pík fragmenty

51 Hmotnostní spektrometrie – blokové schéma vzorek ionizační komora elektrostatické prvky disperzní prvek svazky iontů zaostřovací plocha detektor registrace analyzátor

52 Způsoby ionizace vzorku náraz elektronu – electron impact EI chemická ionizace - CI bombardování rychlými elektrony - FAB elektrosprej - ESI chemická ionizace za atmosférického tlaku - APCI fotoionizace - APPI MALDI – matrix asisted laser desorption ionization

53 Způsoby ionizace vzorku Electron impact paprsek vysokoenergetických elektronů (70 eV) vyrazí elektron z molekuly a vzniká kladně nabitý radikál-kation (molekulární ion) pokud je molekulární ion nestabilní, dochází k fragmentaci.

54 Způsoby ionizace vzorku Chemická ionizace v iontovém zdroji je přítomen plyn, který je ionizován elektronovým paprskem. Tento plyn se ionizuje. Srážkami s molekulami analytu se na analyt přenáší náboj – vzniká kation, který má málo energie na to, aby dále fragmentoval šetrný způsob ionizace, hlavním produktem je molekulární ion IH + + M  MH + + I nebo I + + M  M + + I

55 Fast atom bombardment vzorek se ionizuje bombardováním paprsky urychlených atomů vhodných prvků – zpravidla Ar, Xe, Cs (energie 5-10 keV)vzorek se ionizuje bombardováním paprsky urychlených atomů vhodných prvků – zpravidla Ar, Xe, Cs (energie 5-10 keV) vzorky se umisťují do polární viskozní a netěkavé kapaliny - glycerolvzorky se umisťují do polární viskozní a netěkavé kapaliny - glycerol užívá se pro určování sekvence v glykozidech a apetidechužívá se pro určování sekvence v glykozidech a apetidech

56 Ionizace elektrosprejem LC eluent je sprejován v komoře za přítomnosti silného elektrostatického pole (za atmosférického tlaku) – vznikají nabité kapičkyLC eluent je sprejován v komoře za přítomnosti silného elektrostatického pole (za atmosférického tlaku) – vznikají nabité kapičky ohřívaný zmlžující plyn (nebo vyhřívaná kapilára) urychluje desolvataci kapiček aerosolu, velikost kapiček se zmenšuje, náboj rosteohřívaný zmlžující plyn (nebo vyhřívaná kapilára) urychluje desolvataci kapiček aerosolu, velikost kapiček se zmenšuje, náboj roste při určité velikosti a náboji kapiček převládnou odpudivé elektrostatické síly nad silami kohezními – coulombická exploze – vznik volných iontůpři určité velikosti a náboji kapiček převládnou odpudivé elektrostatické síly nad silami kohezními – coulombická exploze – vznik volných iontů volné ionty jsou přitahovány a posléze prochází vzorkovací ústí do MSvolné ionty jsou přitahovány a posléze prochází vzorkovací ústí do MS

57 Chemická ionizace za atmosférického tlaku eluent je sprejován vyhřívaným odpařovákem (250 – 400 °C)eluent je sprejován vyhřívaným odpařovákem (250 – 400 °C) dochází k odpaření eluentudochází k odpaření eluentu plynný solvent je ionizován elektrony v koronovém výboji (výbojová jehla)plynný solvent je ionizován elektrony v koronovém výboji (výbojová jehla) ionty solventu předávají náboj chemickou reakcí analytům (chemická ionizace)ionty solventu předávají náboj chemickou reakcí analytům (chemická ionizace) APCI se používá pro méně polární analyty než elektrosprej – je k elektrospreji komplementárníAPCI se používá pro méně polární analyty než elektrosprej – je k elektrospreji komplementární u většiny přístrojů je výměna APCI za ESI snadnáu většiny přístrojů je výměna APCI za ESI snadná někdy se oba mody i kombinujíněkdy se oba mody i kombinují

58 Fotoionizace - APPI eluent je sprejován vyhřívaným odpařovákem stejně jako APCIeluent je sprejován vyhřívaným odpařovákem stejně jako APCI výbojka generuje fotony v úzkém rozsahu ionizačních energiívýbojka generuje fotony v úzkém rozsahu ionizačních energií ionizační energie jsou voleny tak, aby ionizovaly analyt a nedocházelo k ionizaci solventuionizační energie jsou voleny tak, aby ionizovaly analyt a nedocházelo k ionizaci solventu podobné použití jako APCIpodobné použití jako APCI význam:význam: 1. analýza velmi málo polárních látek 2. malé průtoky (<100  l/min) APPI je nejmladší technikaAPPI je nejmladší technika

59 MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization zvláště šetrný způsob ionizace, vhodný pro makromolekulyzvláště šetrný způsob ionizace, vhodný pro makromolekuly vzorek je spole s matricí (např. hydroxykyseliny) nasesen na terčíkuvzorek je spole s matricí (např. hydroxykyseliny) nasesen na terčíku na terčík se namíří laserový paprsek – dojde k excitaci matrice a přenesení energie na analyt -> vznikají ionty, které jsou urychleny do analyzátoruna terčík se namíří laserový paprsek – dojde k excitaci matrice a přenesení energie na analyt -> vznikají ionty, které jsou urychleny do analyzátoru

60 Analyzátory separace analytů podle různých hodnot m/zseparace analytů podle různých hodnot m/z určité nastavení analyzátoru odpovídá určité hodnotě m/z (kalibrace)určité nastavení analyzátoru odpovídá určité hodnotě m/z (kalibrace) 1. Sektorové analyzátory

61 Kvadrupóly

62 Detektor doby letu – time of flight (TOF) rychlost měření přesných hmot analýza velkých molekul

63 Iontová past – možnost MS n

64 Iontová cyklotronová rezonance cyklotronová frekvence převrácená hodnota m/z při excitaci iontu oscilátorem s frakvencí stejnou jako je cyklotronová frekvence dochází ke spirálovitému pohybu (m/z(A)

65 Iontová cyklotronová rezonance před excitací při excitaci po excitaci změna oscilace se měří jako střídavý proud. Jeho amplituda odpovídá počtu iontů – kvantita Frekvence odpovídá cyklotronové frekvenci iontu Rf excitace detegovaný proud Fourierova transformace běžné spektrum


Stáhnout ppt "Přehled analytických metod II.. Metody atomová spektrometrie (AAS, AES, kvantometry) molekulová spektrometrie (UV/VIS, IČ, NMR) chromatografie (GC, HPLC,"

Podobné prezentace


Reklamy Google