Pracovní metody v botanice: karyologie + průtoková cytometrie

Prezentace na téma: "Pracovní metody v botanice: karyologie + průtoková cytometrie"— Transkript prezentace:

1 Pracovní metody v botanice: karyologie + průtoková cytometrie
160 320 480 640 800 250 500 750 1000 2x 4x Relative fluorescence Number of nuclei karyologie + průtoková cytometrie

2 K a r y o l o g i e = studium buněčného jádra, zejména chromozómů
charakteristiky chromozómů: - počet - morfologie - velikost (absolutní i relativní) - barvitelnost

3 Počty chromozómů - počet chromozómů (haploidní buňky: n
somatické buňky: 2n) - základní chromozómové číslo (x) - akcesorické (B) chromozómy - polyploidie - aneuploidie - somatické mozaiky - endopolyploidie

4 Počty chromozómů - rekordy
Haplopappus gracilis 2n = 4 Viola modesta Ophioglossum reticulatum 2n = 96x = 1440 Sedum suaveolens - 2n = 80x = 640 Voaniola gerardii - 2n = 50x = 596

5 Stavba chromozómů

6 Morfologie chromozómů
- centroméra, sekundární konstrikce, satelit - difúzní centroméra

7 Změny tvaru chromozómů
- pericentrické inverze - nerovnoměrné translokace - delece, duplikace - fúze

8 Charakteristiky karyotypu
- symetrický x asymetrický (evoluce) - bimodální

9 Velikost chromozómů - polyténní chromozómy - B chromozómy
cévnaté > bezcévné heterosporické > homosporické nahosemenné > krytosemenné bylinné typy > dřevnaté

10 Obsah jaderné DNA C-hodnota velikost genomu Fritillaria assyriaca
C = pg Arabidopsis thaliana C = 0.1 pg

11 Barvitelnost chromozómů
- euchromatin x heterochromatin - pohlavní chromozómy

12 A n e u p l o i d i e - hypo-aneuploidie - hyper-aneuploidie

13 P o l y p l o i d i e - ortopolyploidie x anortopolyploidie
- autopolyploidie x allopolyploidie - výhody polyploidů

14 Allopolyploidie - Primula
Primula floribunda 2n = 2x = 18 Primula kewensis 2n = 2x = 18 2n = 4x = 36 Primula verticillata 2n = 2x = 18

15 Allopolyploidie Galeopsis pubescens 2n = 2x = 16 Galeopsis speciosa
Galeopsis tetrahit 2n = 4x = 32 Galeopsis pubescens 2n = 2x = 16 Galeopsis speciosa 2n = 2x = 16

16 Allopolyploidie

17 Autopolyploidie Dactylis glomerata 2n = 2x = 28 Dactylis polygama

18 Tragopogon porrifolius
Polytopní vznik Tragopogon porrifolius 2n = 2x = 12 Tragopogon pratensis 2n = 2x = 12 Tragopogon dubius 2n = 2x = 12 Tragopogon miscellus 2n = 4x = 24 Tragopogon mirus 2n = 4x = 24

19 Buněčný cyklus

20 Mitotické dělení

21 Meiotické dělení

22 Metody - roztlakové preparáty
- výběr materiálu 1) předpůsobení 1-bromnaftalen (nasycený roztok, 0,5 - 4 hod.) p-dichlorbenzen (bnasycený roztok, hod) 8-hydroxychinolin (0,002 M, hod) kolchicin (0,01 - 0,5 %, 0,5 - 3 hod) 2) fixace ethanol : ledová kys. octová (3 : 1), hod. 3) macerace ethanol : HCl (1 : 1), min. 1N - 2N HCl, 60°C, min 4) barvení lakto-propion-orcein acetokarmín

23 Metody - roztlakové preparáty

24 Metody - průtoková cytometrie

25 Příprava FCM vzorků

26 Výhody průtokové cytometrie
- rychlost - jednoduchá příprava vzorků - nedestruktivnost - nevyžaduje mitoticky aktivní buňky - detekce smíšených vzorků

27 Využití průtokové cytometrie
Analýza protoplastů (velikost, obsah DNA, RNA, proteinů, chlorofylu, alkaloidů, buněčný cyklus, syntéza buněčné stěny, třídění) Analýza izolovaných jader (obsah DNA, poměr AT:CG bází, struktura chromatinu, obsah RNA, proteinů, třídění) Analýza izolovaných chromozómů (velikost, centromerický index, obsah DNA, poměr AT:GC bází, třídění)

28 Botanické aplikace Podrobnější analýza jaderného genomu
(velikost, složení genomu u allopolyploidů, odhad poměru AT:CG bází) Analýza ploidního stupně (detekce nových ploidií, detekce heteroploidních kříženců, detekce endopolyploidie, detekce aneuploidie, určení pohlaví dioecických rostlin, detekce reprodukčního způsobu) Další aplikace (struktura chromatimu, analýza buněčného cyklu, vliv radiace, třídění chromozómů)

29 Determinace druhů a jejich hybridů
Anthoxanthum 2x - A. alpinum 4x - A. odoratum Empetrum 2x - E. nigrum 4x - E. hermaphroditum Veronica hederifolia agg. 2x - V. triloba 4x - V. sublobata 6x - V. hederifolia

30 Determinace druhů a jejich hybridů
Polypodium cambricum 2n = 2x = 74 Polypodium vulgare 2n = 4x = 148 Polypodium interjectum 2n = 6x = 222 2x 6x

31 Determinace druhů a jejich kříženců
Empetrum - 3x Dryopteris

32 Otázky vyšších taxonomických kategorií
- Ranunculaceae s.l. - vývojové centrum (Hypochaeris)

33 Obsah jaderné DNA - využití
- objem jádra a buňky - délka mitózy a meiózy - hmotnost a objem semen - minimální reprodukční doba - fenologie - parametry prostředí - molekulární praxe (AFLP) - fylogenetické analýzy

34 Příbuzenské vztahy Rozdíly v C - hodnotách H. pilosella C = 1.74 pg
H. lactucella C = 2.03 pg H. onegense C = 2.11 pg H. caespitosum C = 2.04 pg H. aurantiacum C = 1.93 pg H. bauhinii C = 1.97 pg H. schultesii C = 1.80 pg (H. lactucella x H. pilosella) H. floribundum C = 2.04 pg (H. lactucella x H. caespitosum) H. brachiatum C = 1.78 pg (H. pilosella x H. bauhini) stejný počet chromozómů rozdílná velikost genomu

35 Analýza reprodukčního způsobu

36 Reprodukční způsob

37 Původ potomstva Experimentální hybridizace 6x x 4x Potomstvo:
160 320 480 640 800 250 500 750 1000 2x 4x Relative fluorescence Number of nuclei Experimentální hybridizace 6x x 4x Potomstvo: 6x (apomixie) 3x (haploidní partenogenéze) 5x (redukované gamety) 7x (redukovaná + neredukovaná gameta) 8x (neredukovaná + redukovaná gameta)

38 Studium smíšených populací
Oxycoccus: Galeobdolon 2x + 4x + 5x + 6x 2x + 3x + 4x Empetrum: Hieracium (echioides) 2x + 3x + 4x 2x + 3x + 4x Anthoxanthum Campanula patula: < 2x + 2x (2x + 4x) 2x + 4x, 6x + 8x

39 Studium smíšených populací
4x 2x 3x Krkonoše Empetrum 2x + 3x + 4x 2x 2x + 3x 3x 4x * Mumlavská hora Jeřábí louka 100 m

40 Další techniky - proužkování - FISH, GISH

41