PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce

Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP)

“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“ Cytosine Guanine

Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end 3’ end konce dsDNA nejsou stejné jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena HO OH T A 5 4 1 3 2 G C T A G C 3’ end 5’ end

Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle iontové síle pH délce DNA

DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny

Vlastnosti DNA polymerasy 1. polymerasová aktivita Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3'-5' exonukleasová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukleasová aktivita - odštěpuje RNA primer

DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINů JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Forward primer dNTPs 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG DNA POL 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG DNA POL 3’ 5’ dNTPs Reverse primer 5’ 3’ GCATATACTCGATTTCT 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’

PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce Nobelova cena 1993

Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let

Jak funguje PCR Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu

Praktické provedení PCR Počáteční denaturace 94oC 3-5 min denaturace 94oC 30 sec annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze počet cyklů 25-35 x

Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza

PCR komponenty Templátová DNA Primery dATP, dTTP, dCTP, dGTP vzorek k amplifikaci Primery krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace dATP, dTTP, dCTP, dGTP volné stavební jednotky DNA Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)

Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu

Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) “Hot start” PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): stupeň degenerace: prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = 65.536 krát “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC G G G G G T T G T C C C C C T T T T T A T

Navrhování primerů Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měly mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 degenerované primery max. 20 bp ideální do degenerace 250x

Příklad navržení primerů: Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’

Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL složení: Templátová DNA 1-1000ng Primery 10 -20 pmols 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl MgCl2 0.5 -3.0 mM 50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2 jednotky Taq polymerasy

Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko

PCR Optimalizace látky ovlivňující kvalitu PCR: Složka specifická amplifikace nespecifická amplifikace AnnealingTeplota - Tm nízká vysoká MgCl2 vysoká nízká KCl vysoká nízká Enzym, Primer vysoká nízká pH nespecificky Formamid nízká vysoká látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd. pro GC-rich templáty Nespecifická amplifikace

RT PCR (reverse transcriptase PCR) Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů

RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA

asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR jednozkumavková reakce PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře fluorometr s automatickým vyhodnocením

multiplex PCR nested PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR

LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily – např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent® polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 °C Pwo 2 hod při 100 °C DeepVent® 8hod při 100 °C

in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů

real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) fluorimetr je součástí termocykleru Real-time PCR monitoruje fluorescenci uvolňovanou jako odezvu na každý uskutečněný cyklus v PCR (v reálném čase). + daleko přesnější oproti end-point barvení EtBr při konvenční PCR - náročné na optimalizaci a vybavení

aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mRNA nebo mikroRNA mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami

princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání

chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů – nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot

chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer

srovnání TaqMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) aplikace kvantifikace SNP detekce cena vysoká nízká

kontaminace největší problém PCR aerosol, pipety, staré amplikony částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsDNA s inkorporovaným deoxyuracilem (dUTP) termolabilní, 0% aktivita nad 55◦C nereaguje s templátem (dTTP) dUTP v qPCR mixu místo dTTP pracuje během nastavení PCR reakce

chyby v pipetování templát (cDNA) premix (primery, proba, polymerasa, dNTP, pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací

lineární vynesení logaritmické vynesení

lineární ~20 do ~1500

CT hodnoty treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky CT počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)

před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku – absolutní kvantifikace templát: 10x ředění buď přímo cDNA, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme CT koncentrace templátu

PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce %EFF – kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu R2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995)

%EFF 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90%  3%

REFERENČNÍ GEN relativní kvantifikace musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích nejčastěji provozní geny (house-keeping) actin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA

TaqMan Human Endogenous Control Plate CT

CT = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci cDNA 18S ribosomální RNA přepisována jinou RNA polymerasou než mRNA byly popsány výkyvy mezi množstvím rRNA a mRNA nelze použít pokud se vychází z mRNA

vyhodnocení sample 1 sample 2 kalibrátor izolace celkové RNA (mRNA) přepis do cDNA navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení standardních křivek pro oba geny a stanovení efektivity GAPDH GAPDH GAPDH GOI GOI GOI

vyhodnocení kalibrátor sample A sample A sample B kalibrátor sample B GAPDH GOI

vyhodnocení změny exprese pro sample 1 metoda „delta delta cé té“ určíme CT pro všechny křivky určíme CT GOI - CT GAPDH pro kalibrátor CT kalibrátor určíme CT GOI - CT GAPDH pro sample 1 CT sample 1 CTsample 1 - CTkalibrátor CT výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2-CT

vyhodnocení počítá se i s efektivitou 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek

3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích

příklad 2-CT 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cDNA a provedeno qPCR s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? GAPDH Eff 77% cDNA kalibrator CT 20,05 cDNA silencing CT 16,97 pkg2 Eff 86% cDNA kalibrator CT 22,48 cDNA silencing CT 22,3 pkg2 cDNA kalibrator 1,1x104 kopií cDNA silencing 1,23x104 kopií 2-CT 2 –(5,33-2,43) GAPDH cDNA kalibrator 1,55x104 kopií cDNA silencing 8,92x104 kopií (1+0,86)0,18/(1+0,77)3,08 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x

navrhování primerů velikost amplikonu 50-150 bp délka primerů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm 58-60◦C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)

navrhování proby délka proby 13-25 bp Tm 68-70◦C GC obsah 50-70% primery se nesmí překrývat s próbou Tm 68-70◦C o 10◦C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5´konci zháší fluorescenci FAM barvy

navrhování primerů a proby

kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon

MGB PROBY minor groove binding stabilizuje vazbu proby na ssDNA výrazně zvyšuje Tm můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm

využití pro alelické diskriminace MGB PROBY využití pro alelické diskriminace

kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cDNA qPCR 6X 3X

kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cDNA qPCR 27X

StepONE Real Time PCR System instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System

zesilovač ccd kamera halogenová lampa emisní filtry excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku

instrumentace

http://www.youtube.com/watch?v=k16WgEU1kVM

Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika)

HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) detekce SNP bez specifických sond díky kvalitní instrumentaci Corbett (0.02◦C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus)

HRM ANALYSA pro amplikony do 200bp

Aplikace PCR a využití v praxi

Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce virových a bakteriálních onemocnění

Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) AS PCR alelicky specifická PCR primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

Aplikace PCR a využití v praxi NEZÁVADNOST POTRAVIN

Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT

Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. EVOLUČNÍ BIOLOGIE ORNITOLOGIE skot ovce prase koza TEST