Stanovení léků a návykových látek Petr Breinek BC_Léky_2011

TDM terapeutické monitorování lékových hladin Soubor činností, jejichž cílem je optimalizovat a individualizovat další dávky léku Součástí TDM je: - Stanovení koncentrace léčiva (příp. jeho metabolitu) v krevním vzorku, odebraného v definovaném časovém intervalu - Interpretace výsledku

Proč se u některých léků stanovuje jejich koncentrace? Hrozí jejich toxický účinek při předávkování Některé mají úzké terapeutické rozmezí (Rozmezí mezi nejnižší koncentrací léku, při které se objevuje jeho účinek a nejvyšší koncentrací, při které se ještě neobjevuje toxický účinek léku) Lékař pozoruje nedostatečný účinek Je potřeba kontrolovat terapii Je podezření, že pacient léky neužívá

Obvykle monitorované léky Imunosupresiva (cyklosporin, takrolimus, sirolimus, mykofenolát) Antiepileptika (karbamazepin, fenytoin, kyselina valproová, fenobarbital) Antibiotika (gentamicin, vancomycin) Bronchodilancia (teofylin) Kardiotonika (digoxin) Cytostatika (metotrexát,busulfan)

V některých případech se stanovují i metabolity léků.

Analyzovaný materiál Plazma Sérum Krev Moč Sliny Mozkomíšní mok Žluč nebo peritoneální tekutina

Odběr vzorku V ustáleném stavu (steady state) Před další dávkou („through“) Kdykoli („random“) Před a po podání („peak“) Doba odběru musí být u každého léku určena + informace o pacientovi: renální funkce, čas podání, dávka

Farmakologie a laboratoř Klinická farmakologie odběr čas odběru interpretace výsledku konzultační činnost hlášení podezření na nežádoucí účinek léku Klinická biochemie preanalytická fáze stanovení terapeutické rozmezí v případě nedostupnosti klinického farmakologa další činnosti

Léky jsou metabolizovány U stanovovaných léků je jejich metabolizmus znám Přibližně u 20% osob probíhá odbourávání léčiv jinou rychlostí, než u většiny osob → vzniká problém při stanovení dávky léku

Co ovlivňuje hladinu léku ve stanovovaném vzorku krve? Původní látka Vstřebávání (absorpce, distribuce) Metabolismus (biotransformace) Vylučování (močí, stolicí, dechem, potem)

Farmakokinetika studuje působení organismu na lék změny koncentrace léku v těle časový průběh koncentrací léku v plasmě

Farmakodynamika studuje působení léku na organismus (orgány, tkáně, receptory) doba účinku stimulace deprese ovlivnění metabolismu

„Rychlí metabolizátoři“ Přeměna léku probíhá rychleji: - nedosáhne se terapeutické rozmezí - účinek léku se neprojevuje - tato situace není tak nebezpečná: lékař zvýší dávkování léku

„Pomalí metabolizátoři“ Přeměna léku probíhá pomaleji: - množství léku v krvi přesahuje terapeutické rozmezí, i když užívá doporučené dávky - často dochází k toxickým projevům až k poškození organismu - závažnější stav

Co to způsobuje? dlouhou dobu se to nevědělo: lék se vysadil nebo změnil u pomalých metabolizátorů je to často zapříčiněno geneticky: vrozené ,,chybění‘‘ nebo změněná funkce některého enzymu (např. cytochrom P450 se podílí na metabolismu asi 30% používaných léků)

Farmakogenetika a farmakogenomika Studují individuální genetický vliv na farmakokinetiku a farmakodynamiku Velká interindividuální variabilita Cílem je individualizace volby léku a jeho dávkování

Současná praxe Sleduje se koncentrace léku v krvi Pacient musí chodit na kontroly (odběry krve) V případě problémů se upraví dávkování, či změní lék..

Budoucnost Začíná se sledovat: buď vrozené chybění nebo změněná forma příslušného enzymu (vedoucí k pomalé přeměně léku v organismu)

Metody stanovení 1. Chromatografické metody HPLC HPLC/MS LC/MS GC/MS TLC

Techniky úpravy vzorků: Extrakce kapalinou Extrakce pevnou látkou (SPE) Ultrafiltrace Derivatizace Extrakce plynem (headspace) Adsorpce Vymrazování

HPLC – jednoduché schéma Pumpa Nanesení vzorku Kolona Eluční činidlo Detektor Zapisovač Převodník signálu Odpad

HPLC

GC–TRACE GC MS – POLARISQ (Finnigan)

2. Imunoanalytické metody a) fluorescenční imunoanalýza (FIA, FPIA, DELFIA) b) enzymová imunoanalýza (EMIT, ELISA, MEIA,CEDIA) c) luminiscenční imunoanalýza (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,…

3. Metody pro odhalování genetického polymorfismu v metabolismu léčiv Lze stanovit: Fenotyp (rychlost transformace) Genotyp (analýza DNA, DNA čipy)

Standardizace Digoxin ID-MS FPIA, EIA, LIA Teofylin Zkouška Referenční metoda CRM Doporučené metody Digoxin ID-MS FPIA, EIA, LIA Teofylin FPIA, EIA, LIA, HPLC Fenytoin SRM 900 Karbamazepin SRM 1599 Kyselina valproová

Jaká je povolená chyba v EHK? Lék TMU (SEKK 2011) Digoxin 24% Amikacin 30% Teofylin 27% Gentamicin Primidon Vankomycin Fenobarbital Metotrexát Fenytoin Karbamazepin Lithium 12% Etosuximid Kyselina valproová

Terapeutické hladiny (příklady) Lék Terapeutická hladina Digoxin 0,5-1,0 µg/l Amikacin Teofylin 8,0-20,0 mg/l Gentamicin 10,4-20,9 µmol/l Primidon 5,0-12,0 mg/l Vankomycin Fenobarbital Metotrexát Fenytoin 10,0-20,0 mg/l Karbamazepin 4,0-10,0 mg/l Lithium 0,5-1,2 mmol/l Etosuximid Kyselina valproová 50,0-100,0 mg/l

CYKLOSPORIN A MYKOFENOLOVÁ KYSELINA Imunosupresiva Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) Referenční meze: podle doby po transplantaci a druhu transplantace Cy A: cyklický polypeptid MPA: aktivní část z léčiva mofetil 29 29

DIGOXIN Odběr: srážlivá krev před podáním nebo 6-11 h po podání Referenční meze: 0,5-1,2 ug/l Srdeční glykosid, je indikován při srdečním selhávání DLIF (digoxin-like immunoreactive factor) DLIS (digoxin-like immunoreactive substance) 30 30

TACROLIMUS Imunosupresivum, FK 506 obchodní název PROGRAF® objev (1984): extrakt z houby (Streptomyces tsukubaensis) japonská farmaceutická firma Fujisawa (kódové č. FK 506) přispívá významnou měrou k dosažení současného stupně rozvoje transplantace orgánů a buněk, používá se také při léčbě závažných autoimunitních onemocnění

je 10x až 100x účinnější ve srovnání s cyklosporinem působí inhibičně v časné fázi aktivačního procesu T lymfocytů metabolizuje se v mikrosomech jaterních buněk (cytochrom P450) existují i závažné nežádoucí účinky (hypertenze, nefrotoxicita,neuropatie, hepatopatie, hyperlipoproteinemie) z toho vyplývá nutnost laboratorního monitorování lékové terapie (TDM)

Analyzovaný materiál pouze krev (EDTA) stabilita +2 až +8°C …………14 dní ≤ -70°C ……………. 2 měsíce koncentrace v krvi je průměrně 35x vyšší (12-67x) než v plazmě

CYKLOSPORIN A MYKOFENOLOVÁ KYSELINA Imunosupresiva Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) Referenční meze: podle doby po transplantaci a druhu transplantace Cy A: cyklický polypeptid MPA: aktivní část z léčiva mofetil

DIGOXIN Odběr: srážlivá krev před podáním nebo 6-11 h po podání Referenční meze: 0,5-1,2 ug/l Srdeční glykosid, je používán při terapii srdečního selhání a srdečních arytmií DLIF (digoxin-like immunoreactive factor) DLIS (digoxin-like immunoreactive substance)

LITHIUM Odběr: srážlivá krev 10-18h po podáním Udržování terapeutické hladiny nebo určení intoxikace Li Terapeutická hladina: 0,5-1,2mmol/l Použití Li: léčba bipolárních chorob (duševní poruchy s cykly deprese a mánie) - profylaxe maniodepresivního onemocnění Stanovení: nejčastěji PES (plamenová emisní spektrometrie)

KYSELINA VALPROOVÁ Odběr: srážlivá krev před podáním Terapeutická hladina: 50,0-100,0 mg/l Antiepileptikum (součást léků pro léčbu epilepsie), někdy používaná k léčbě migrény a bipolárních chorob)

FENYTOIN Odběr: srážlivá krev Terapeutická hladina: 10,0-20,0 mg/l; volný fenytoin 1,0-2,0 mg/l (8-14%) Antiepileptikum ze skupiny hydantoinů (5,5-difenylhydantoin); lék pro léčbu epilepsie; aktivní je jen volný fenytoin (většina je vázána v krvi na bílkoviny- část neaktivní)

Toxikologie a návykové drogy

Drogový screening = detekce přítomnosti povolených i nepovolených návykových látek v biologickém materiálu (moč, vlasy, sliny, krev, pot) Důvody: Klinické Léčebné Soudní Sportovní testování

Jak je vyšetření prováděno? Požadavek zní : je droga přítomna? První vyšetření je screeningové (nespecifické!) V některých případech následuje potvrzení (konfirmace)

Vyšetřované skupiny návykových látek Amfetaminy Benzodiazepiny Kanabinoidy Kokain Opiáty (Psilocin a psilocybin - halucinogenní houby) Fencylidin (CP) LSD Zákon 167/1998 Sb.O návykových látkách; Seznam omamných a psychotropních látek

Příklad testu na drogy DynexTest®SalivaScreen Nanesení vzorku Odečíst výsledek po 10min Negativní výsledek: 2 proužky Pozitivní výsledek: 1 proužek v kontrolní oblasti Amfetamin Metamfetamin (pervitin) THC (marihuana) Opiáty (morfin/heroin) kokain

Jiný příklad: Kazetový test Syva®RapidTest (pozitivní na amfetaminy)

Alkohol (etanol) Widmarkova zkouška Enzymové metody Plynová chromatografie (GC) Widmarkova zkouška Enzymové metody Imunoanalytické metody

3CH3CH2OH + 2Cr2O72- + 16H+ = 3CH3COOH + 4Cr3+ + 11H2O Widmarkova zkouška nespecifická - volumetrické stanovení všech redukujících látek založené na jodometrické oxidačně-redukční titraci: 3CH3CH2OH + 2Cr2O72- + 16H+ = 3CH3COOH + 4Cr3+ + 11H2O   Cr2O72- + 6I- + 14H+ = 2Cr3+ + 3I2 + 7H2O I2 + 2S2O32- = 2I- + S4O62-

Enzymové stanovení etanolu Oxidace etanolu pomocí alkoholdehydrogenázy C2H5OH + NAD+ = CH3CHO + NADH+H+ (AlDH) Etanol Acetaldehyd

Amfetaminy Metamfetamin (Pervitin) Amfetamin Methylenedioxymetamfetamin (MDMA, Extáze) Efedrin Fenmetrazin, Fentermin Cut-off: 1000 ng/ml Doba záchytu v moči: MA a metabolity 3 až 5d po ukončení aplikace Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS

Benzodiazepiny (BZD) Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam, Diazepam, Flunitrazepam, atd. Cut-off: 300 ng/ml (↓) Doba záchytu v moči: 1 až 7d Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS (?)

Kanabinoidy (obsažené v marihuaně) delta-9-tetrahydrokannabinol (THC) Cannabinol (CAN) Cannabidiol (THC-COOH) Cut-off: 50 ng/ml Doba záchytu v moči: 1 až 3d po jednorázové dávce; až 30d u chronických uživatelů Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS (ve vlasech 2 až 3 měsíce)

Kokain Kokain Crack (volá báze kokainu) Cut-off: 300 ng/ml Doba záchytu v moči: 3 až 6h; 24-6h metabolity; až 5d u chronických uživatelů Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS

Opiáty Morfin Heroin (diacetylmorfin) Braun (hydrokodon) Kodein Ethylmorfin Dihydrokodein, … Cut-off: 300 ng/ml (morfin) Doba záchytu v moči: až 3d po poslední dávce Potvrzení pozitivních výsledků – GC/MS

Metody stanovení 1. Chromatografické metody HPLC HPLC/MS LC/MS GC/MS TLC

2. Imunoanalytické metody a) fluorescenční imunoanalýza (FIA, FPIA, DELFIA) b) enzymová imunoanalýza (EMIT, ELISA, MEIA,CEDIA) c) luminiscenční imunoanalýza (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,…