Imunitní systém jako informační soustava Cytokiny M.Průcha

Imunitní systém - úkoly Zachování homeostázy Zachování integrity makroorganismu Rozpoznání cizího a vlastního

Imunitní systém - signální systém Solubilní faktory – vysokomolekulární ( cytokiny, chemokiny, růstové faktory) - lipidové – eikosanoidy - nízkomolekulární - NO

Imunitní systém – signální systémy Membránové interakce - receptory - adhezní molekuly - kostimulační molekuly - akcesorní molekuly

Hráči v přenosu signálu Imunokompetentní buňky Trombocyty, erytrocyty Endotelové buňky Epitelové buňky Keratinocyty, fibroblasty Buňky nervové a endokrinní soustavy Molekuly mezibuněčné hmoty

Cytokiny - funkce Aktivační signály, které se podílejí na buněčné aktivaci, regulaci buněčného cyklu Autokrinní, parakrinní a systémové působení Regulace exprese povrchových, kostimulačních a akcesorních molekul

Cytokiny - funkce Změny buněčného cytoskeletu Indukce apoptózy Regulace zánětu Regulace proliferace a diferenciace buněk imunitního systému

Cytokiny – receptory 5 rodin receptorů pro cytokiny Receptory pro hematopoetinové cytokiny Receptory pro interferony α,β,γ a IL-10 Receptory pro TNFα Receptory pro IL-1, M-CSF a další Transmembránový receptor – serpentinová molekula – vazba chemokinů

Cytokiny – nitrobuněčný přenos aktivačního signálu Vazba ligandu na receptor –aktivace Janusových kináz(JAK – Janus Activated Kinase) – ty fysforylují receptorové podjednotky a umožňují vazbu cytoplasmatických molekul – STAT (Signal Transducers and AcTivators – ty přecházejí do jádra a váží se na regulační sekvence genů – to vede k přepisům genů, popř. k indukci buněčné proliferace a diferenciace

Activated Tissue Transglutaminase Caspase Cascade Ca2+ Fas 2009 ProteinLounge.com C GRB TNF Calcium Channel GranzymeB TNFR F a s L Perforin Perforin GRB RAIDD RIP2 ER Stress Daxx TRADD Caspase2 Ca2+ Caspase12 FADD FADD Procaspase8 Caspase2 NIK Caspase8 TRADD Calpain JNK Caspase10 RAIDD TRADD Sphingo- myelinase BID RICK TRAF2 Caspase8 NF-kB Caspase1 Activated Tissue Transglutaminase Ceramide Caspase2 tBID SMAC/ DIABLO CIAP CytoC Kinase Caspase 3,6,7 CIAP CRMA Review: Caspases are a family of cysteine proteases that act in concert in a cascade triggered by apoptosis signaling. The culmination of this cascade is the cleavage of a number of proteins in the cell, followed by cell disassembly, cell death, and, ultimately, the phagocytosis and removal of the cell debris. The Caspase cascade is activated by two distinct routes: one from cell surface and the other from mitochondria (Ref.1). The pathway leading to Caspase activation varies according to the apoptotic stimulus. Initiator Caspases (including 8, 9, 10 and 12) are closely coupled to pro-apototic signals. Pro-apoptotic stimuli include the FasL (Fas Ligand), TNF (Tumor Necrosis Factor), Granzyme-B, GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), DNA damage, Ca2+ (Calcium) channels and ER (Endoplasmic Reticulum) stress. Once activated, these Caspases cleave and activate downstream effector Caspases (including 3, 6 and 7). Caspase8 cleaves BID (BH3 Interacting Death Domain). tBID (Truncated BID) disrupts the outer mitochondrial membrane to cause release of the pro-apoptotic factors CytoC (Cytochrome-C) which is crucial for activating pro-Caspase9. CytoC that is released from the intermembrane space binds to APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1), which recruits Caspase9 and in turn can proteolytically activate Caspase3. SMAC (Second Mitochondria-Derived Activator of Caspase)/DIABLO is also released from the mitochondria along with CytoC during apoptosis, and it functions to promote caspase activation by inhibiting IAP (Inhibitor of Apoptosis) family proteins. ER stress leads to the Ca2+-mediated activation of Caspase12 (Ref.2). Fas and the TNFR (TNF Receptor) activate Caspases8 and 10. Cell death caused by activation of the TNFR or Fas receptors is brought about by the recruitment of the adaptor protein FADD (Fas Associated Death Domain). In the case of the TNFR1, FADD recruitment requires prior binding of TRADD (TNFR-Associated Death Domain Protein). FADD in turn recruits ProCaspase8. The TNFR1 receptor can also mediate activation of Caspase2 via the recruitment of a death-inducing signaling complex. In this case RIP (Receptor-Interacting Protein) acts as an adaptor for the recruitment of RAIDD (RIP-Associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a Death Domain), which subsequently binds to ProCaspase2. TNFR also activates Caspase3, 6,7 via TRADD, TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor-2) and RICK (RIP-like Interacting Clarp Kinase). TNF not only induces apoptosis by activating Caspase8 and 10, but can also inhibit apoptosis signaling via NF-KappaB (Nuclear Factor-KappaB), which induces the expression of IAP, an inhibitor of Caspases3, 7 and 9 (Ref.3). GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), Granzyme B and perforin proteins released by cytotoxic T-Cells induce apoptosis in target cells, forming transmembrane pores, and triggering apoptosis, perhaps through cleavage of Caspases, although Caspase-independent mechanisms of Granzyme-B mediated apoptosis have been suggested (Ref.4). After activation, down stream Caspases cleave cytoskeletal and nuclear proteins (structural, signaling proteins or kinases) like PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase), DNA-PK (DNA-Dependent Protein Kinase), Rb (Retino Blastoma Tumor Supressor Protein), PAK1 (p21-Activated Kinase-1), GDID4, Fodrin, Lamin-A, Lamin-B1, Lamin-B2, thus inducing apoptosis. Caspase3 cleaves ICAD (Inhibitor of CAD) to free CAD (Caspase-Activated DNase) to cause DNA fragmentation. The events culminating in Caspase activation and the subsequent disassembly of the cell are the subject of intense study because of their role in many neurodegenerative disorders such as Parkinson's and Alzheimer’s diseases, autoimmune disorders, and tumorigenesis. References: 1. Srinivasula SM, Ahmad M, Fernandes-Alnemri T, Alnemri ES. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization. Mol Cell. 1998 Jun;1(7):949-57. PubMed ID: 9651578 2. Pirnia F, Schneider E, Betticher DC, Borner MM. Mitomycin C induces apoptosis and caspase-8 and -9 processing through a caspase-3 and Fas-independent pathway. Cell Death Differ. 2002 Sep;9(9):905-14. PubMed ID: 12181741 3. Swanton E, Savory P, Cosulich S, Clarke P, Woodman P. Bcl-2 regulates a caspase-3/caspase-2 apoptotic cascade in cytosolic extracts. Oncogene. 1999 Mar 11;18(10):1781-7. PubMed ID: 10086332 4. Pinkoski MJ, Heibein JA, Barry M, Bleackley RC. Nuclear translocation of granzyme B in target cell apoptosis. Cell Death Differ. 2000 Jan;7(1):17-24. PubMed ID: 10713717 CytoC APAF1 Caspase9 PAK1 BAD CLEAVAGE OF DEATH SUBSTRATES Cell Survival Rb Lamin-A Lamin-B1 Lamin-A Lamin-B2 D4-GDI ICAD CAD PARP DNA-PK ICAD Cleaved CAD Apoptosis DNA Fragmentation Apoptosis 14

Regulace koncentrace cytokinů Nutnost lokální regulace Neutralizace vazbou na přirozené inhibitory (IL-1Ra) a solubilní formy receptorů Vazba na makromolekuly buněčných povrchů a mezibuněčné hmoty Uvolňování z lokálních rezervoárů (mezibuněčná hmota- matrixové metaloproteinázy, elastázy, aktivátory plasminogenu, heparanázy

Cytokiny – regulace koncentrace Degradační enzymy rozloží mezibuněčnou hmotu a a umožní prostup buněk imunitního systému do tkání, kde pak uplatní svou vlastní produkci DARC (Duff Antigen Receptor for Chemokines, CD234) na ery a endotelových bb. Vazba CXC a CC chemokinů a odstranění z oběhu

Cytokiny - členění Charakteristika na molekulové úrovni Aminokyselinové složení a struktura, lokalizace genu odpovědného za produkci Klonace genu Zdroj cytokinů, buněčný substrát

Cytokiny - členění Růstové faktory krvetvorby Interferony I. a II. třídy Interleukiny – stimulující hematopoezu, pluripotentní - prozánětlivé a regulující kooperaci Ta B lymfocytů, protizánětlivé Chemokiny Rodina TNFα Rodina TNFβ

Cytokiny regulující krvetvorbu STF (Stem Cell Factor) IL-3 – produkovaný T ly a NK bb. (pluripotentní kolonie stimulující faktor) Kolonie stimulující faktory (G-CSF, GM-CSF a M-CSF) Klinické použití – léčba neutropenií po indukci cytostatickou léčbou

Interferony Interferony I. typu – α,β,ω Stimulátor – virová infekce Antiproliferativní, cytostatický účinek IFN α – leukocyty (chron.akt.hepatitida B, C, leukemie z vlasatých buněk IFN β – léčba RS IFN γ – Th ly , obrana – intracelulární parazité (M.tuberculosis)

Cytokiny regulující T a B lymfocytární systém Heterogenní skupina Prototypem je IL-2 Th0, Th1 a Th2 subsety Rozdílný profil produkovaných cytokinů Th1 – buňkami zprostředkovaná specifická imunita Th2 syntéza protilátek a diferenciace eosinofilů

Pluripotentní prozánětlivé cytokiny IL – 6 a IL-1 Produkce aktivovanými monocyto-makrofágovými bb IL- 1 – endogenní pyrogen Aktivace T ly Produkce RAF

Rodina tumor nekrotizujících faktorů LPS jako podnět Aktivace přes LBP a CD14 Úloha v regulaci zánětu Klinické aplikace –diagnostické i terapeutické – inhibitory TNF

Transformující růstové faktory TGFβ Růstový aktivátor, růstový inhibitor Chemoatraktant fibroblastů Protizánětlivý účinek Aktiviny a inhibiny

Chemokiny M.h. < 10 000 Regulace pohybu buněčných populací Prozánětlivé účinky Produkovány všemi jadernými buňkami Stimulace endo i exogenně Členění do skupin podle přítomnosti cysteinových zbytků IL-8

Metody stanovení cytokinů In vivo, ex vivo, in vitro In vivo – uplatnění – septické stavy Ex vivo – septické stavy, funkční stav při onemocnění, stimulace in vivo a produkce in vitro

Metody stanovení Chemiluminiscence – IL-10, IL-6 Bead Array Systém – průtoková cytometrie ELISA ELISPOT mRNA – klidový stav, aktivace

Indikace vyšetření Sérum – IL-6,8,10 – SIRS, trauma, sepse Ex vivo produkce TNF – sepse Lokálně – zánětlivá onemocnění

Metody stanovení Produkce v supernatantu – ELISA ELISPOT Enzyme – linked Immunospot Assay Principem metody je vazba cytokinu produkovaného specifickou buňkou na protilátku vázanou na destičku

ELISPOT Použití periferních mononukleárních buněk Specifická stimulace studovaných buněk odpovídajícím stimulem po dobu, která je nutná pro prezentaci antigenu Inkubace PBMC s antigenem(bílkovina, peptid), poté přenos aktivovaných T lymfocytů na mikrotitrační destičky Po inkubaci (6-24 hodin) jsou buňky lyzovány, odmyty a přidána biotinem značená druhá protilátka proti testovanému antigenu Detekce pomocí streptavidinu konjugovaného s křenovou peroxidázou

ELISPOT Vyhodnocení – inverzní mikroskop ELISPOT reader – digitální analýza obrazu Detekce a kvantifikace specif. T lymfocytů v periferní krvi Sledování průběhu nemoci Sledování vlivu léků na produkci cytokinů in vitro Autoimunita, transplantace