Autoimunitní onemocnění

Autoimunitní onemocnění Wittebského kriteria Je charakterizován autoantigen a poškozujicí reakci lze reprodukovat in vitro nebo in vivo (přenosem faktorů séra nebo buněk na experimentální zvíře

Autoimunitní reakce humorální typ - tvorba autoprotilátek s následným cytotoxickým účinkem nebo ukládáním IK (II. A III. typ imunopatologické reakce Buněčný typ – působení Tc a Th1 lymfocyty, cytokinovými působky a aktivací makrofágů (IV. typ reakce)

Tolerance Mechanismy udržující imunitní reakci vůči vlastním tkáním ve fyziologických mezích Prolomení autotolerance = vznik autoimunity Centrální a periferní tolerance Thymus a kostní dřeň Pozitivní selekce – thymus – jsou zachovány T ly rozpoznávající vlastní Negativní selekce – eliminace lymfocytů , které rozeznávají komplexy MHC-vlastní peptid s příliš vysokou afinitou Kostní dřeň – negativní selekce B ly

Příčiny vzniku autoimunity Multifaktoriální Vnitřní genetické ( 25-70% výskyt u jednovaječných dvojčat) Zevní Výskyt onemocnění u jednovaječných dvojčat a experimentální modely

Vnitřní faktory Asociace s MHC – asociace s určitým haplotypem – HLA-B 27 Geny kodující cytokiny Geny řídící a regulující apoptózu Asociace s imunodeficity Polymorfismus genů kodujících TCR a H řetězce Ig Humorální faktory

Vnější faktory Infekce, stres, léky, UV záření Infekce odkryje nedostupné autoantige ny(kryptické antigeny) Zánětlivé cytokiny způsobí ektopickou expresi MHC molekul II. Třídy a napomáhají prezentaci peptidů , které jsou jinak nepřístupné Exprese kostimulačních molekul Molekulární mimikry Mikrobiální superantigeny – polyklonální aktivace T ly včetně autoreaktivních, stejně tak B lymfocytů

Rozdělení autoimunitních onemocnění Systémová a orgánově specifická Incidence autoimunitních onemocnění – 5% Systémová – reakce proti konzervovaným strukturám jaderných a orgánově nespecifických antigenů

Systémová autoimunitní onemocnění SLE ( ANA, anti-ds DNA) RA (Fc částem Ig – RF) Dermatopolymyositida ( ENA – Jo-1, PM-Scl) Sjogrenova choroba ( ENA-SS-A, SS-B) Systémová sklerodermie (Scl 70) Smíšená choroba pojiva (U1-RNP) Antifosfolipidový sy (ACLA) Vaskulitidy (ANCA) Sarkoidóza

Orgánově lokalizovaná autoimunitní onemocnění Ulcerozní kolitida (ANCA) Crohnova choroba (Saccharomyces cerevisae – nejde o autoprotilátky) Celiakie (antigeny endomysia – tkánová transglutamináza Autoimunitní hepatitidy (autoantigeny –enzymy CYP 450, SLA-solubile liver antigen, LKM-1 anti liver kidney microsomes PBC (mitochondriální autoantigeny) Plicní fibróza (ANCA, proti cytokeratinům)

Orgánově specifická autoimunitní onemocnění Autoimunitní endokrinopatie – Hashimotova tyreoiditida, Graves-Basedova choroba (tyreotoxikosa), juvenilní DM, Addisonova choroba (proti kůře nedledvin), atrofická gastritida a perniciozní anémie, autoimunitní poruchy reprodukce, autoimunitní polyglandulární sy Autoimunitní neurologická onemocnění – Myasthenia gravis (Ab proti Ach receptoru), periferní demyelinizační neuropatie, RS Autoimunitní cytopenie

Imunofluorescence Reakce antigen – protilátka Přímá a nepřímá Přímá - specifická protilátka označená fluoresceinem Nepřímá - k řezu tkáně nebo suspenze se přidá vyšetřovaný vzorek , následně specifická protilátka se vizualizuje druhou protilátkou konjugovanou vhodným fluorochromem Diagnostika autoprotilátek Substráty – tkáňové řezy, buněčné suspenze, fixovaná tkáňová kultura Protilátky – primární protilátka je přítomna v séru, sekundární protilátka ( králičí, kozí, myší) proti lidské Fc části imunoglobulinové molekuly

Imunofluorescence – orgánově nespecifické Hep 2 – (buněčná lidie lidského nazofaryngeálního karcinomu ANA , cílová struktura – jádro Typy fluorescence – homogenní - anti-dsDNA, periferní a zrnitá – ENA Critidium lucilliae – prvok s kinetoplastem, kinetoplast Lidské neutrofilní leukocyty – ANCA – cytoplazma, granula neutrofilů c- ANCA (cytoplazmatický typ, proteináza 3), pANCA (periferní typ, myeloperoxidáza) a A-ANCA (atypická fluorescence)

Orgánově nespecifické autoprotilátky Opičí jícen – antiendomysiální protilátky (EMA) cílový antigen – tkáňová transglutamináza Krysí ledviny – AMA antimitochondriální, ledvinné tubuly , dehydrogenázy 2-oxo kyselin Krysí žaludek – pariet. bb(GPCA) cílový antigen – K+/H+ATPáza a vnitřní faktor, hladký sval (ASMA) Opičí ledviny – bazální membrána glomerulů (anti GBM), antigen – kolagen IV Krysí játra a ledviny – autoprotilátky proti mikrosomům (LKM), hepatocyty a tubulární buňky ledviny, cílový antigen – cytochrom P450

Fluorescence Fluorochromy – fluoresceinizothiokyanát (FITC), ve světle o vlnové délce 490 nm emituje zelené světlo 517 nm Tetrametylrhodamin – červené světlo (absorbce 550 nm, excitace 580 nm) Subjektivní hodnocení, autofluorescence Přístrojové vybavení – fluorescenční mikroskop s dopadajícím světlem manipulace s protilátkami – rozmrazení a zmrazení, sluneční světlo

Imunohistochemické metody Vizualizace konkrétní molekuly v buňkách a tkáních Princip vazby antigenu a protilátky – polyklonální, monoklonální Přímá a nepřímá Příprava buněk a tkání , parafín, zmrazené tkáně Světelná nebo elektronoptická mikroskopie Fixace (paraformaldehyd, aceton, metanol)) nebo permeabilizace buněčné membrány (Triton X-100) Vyšetření buněčných suspenzí – příprava pomocí cytocentrifugy (cytospin) – BAL, likvor

Imunohistochemie Imunohistochemická reakce – nespecifická (hydrofobní nebo iontová interakce), proto blokace Hovězí albumin nebo neimunní imunoglobuliny(ředěné sérum zvířete) Ředění Značení protilátek – alkalická fosfatáza nebo peroxidáza Metoda vícenásobného značení – protilátky od různých zvířecích druhů – myší a králičí/kozí, protilátka druhého kroku je značená fluorescenčně Subjektivní hodnocení – preparát vs. Pozadí Úskalí metody – ko vzorky , blokující peptid od výrobce – syntetický peptid použitý k imunizaci a získání protilátky –smíchání vzorku protilátky s blokujícím peptidem dojde k vyvázání Fab fragmentu ¨protilátky a reakce by měla být negativní

Imunohistochemie Využití Složení buněčného infitrátu u autoimunitních chorob, detekce imunokomplexů a složek komplementu v tkáních, typizace lymfomů Vybavení – mikroskop , mikrotom, lednice -80C, pH metr Cave!!! Opakované rozmrazení a zmrazení Zvýšení dostupnosti antigenního epitopu – opracování v mikrovlnné troubě nebo enzymatickým natrávením komerčně dostupnými systémy