Laboratoř Oční kliniky VFN a 1. LF UK Kateřina Jirsová Oční Tkáňová Banka VFN a 1. LF UK

laboratoř Oční kliniky OTB 1.získávání, příprava tkání pro transpl. účely 2.použití tkání - transplantace 1.diagnostika a výzkum 2.metody

OTB: získávání, příprava, uchovávání a distribuce tkání pro transplantace v očním lékařství TKÁNĚ: oční: rohovka celý bulbus skléra limbální buňky (kultivace) jiné: amnion

IDEÁLNÍ ROHOVKA PRO TRANSPLANTACI nesmí být zdrojem kontaminace (ba, viry, priony) zdravá, bez mechanických, degenerativních, či jiných poškození kvalita endotelu - počet buněk (min buněk na mm 2 ) refrakčně vhodná bez antigen-prezentujících buněk HLA typizovaná neztluštělá (bez edému)

v médiích vlhká komůrka kryo- konzervace hypotermie tkáňová kultura USAEvropa 4°C-197 °C4 °C31- 37°C  48 h (24) roky  14 d (3 – 7)  36 d OTB MOŽNOSTI UCHOVÁVÁNÍ ROHOVEK

kadaverózní tkáň -do 80l, 24 h p.m., -nesouhlas s odběrem -neznámá příčina smrti kontraindikace -aktivní syst. infekce -neurodegener. onemocnění -lymfomy, leukémie -oční onemocnění, chirurgie -intoxikace 1. ODBĚR TKÁNĚ Enukleace Excize in situ orgánové x tkáňové odběry živí x zemřelí: HB, NHB

2. MIKROBIOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ  HIV 1, 2  Hepatitis B  Hepatitis C  Syphilis CMV, HTLV, EBV

3. REGISTRACE TKÁNĚ evidence archivace přidělení kódu vložení do databáze

Makroskopické hodnoceníBiomikroskopie Vyřazeny bulby: -rohovky abnorm. tvaru -cizí těleso, nečistoty -stromální zákaly -známky chir. zákroků - výrazné defekty epitelu -jizvy -známky patolog. stavů 4. HODNOCENÍ TKÁNĚ

5. DEKONTAMINACE oplach ultračisou vodou PVP-jód thiosíran Na + PBS (fosfátový pufr) 6. PREPARACE

7. MIKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ trypanová modř (0.15%, 90s), sacharóza – hypotonický roztok (0.9 and 1.8%, 2 min), fosfátový pufr

Rohovka – anatomie, funkce ENDOTEL 1 buněčná vrstva (bariéra) 6000bek/mm2 při narození  3500/5l c postmitotický (G1)  0.6%  /rok  (2300/80l) sekrece kolagenu Na/K ATPáza permeabilita, živiny pro stro, ZO STROMA transparence (paralel. uspořádání vláken kolagenu), KC- MFB,FB + DC DESCEMETOVA MEMBR. (BM endo,kolagen IV, VIII) BAWMANNOVA MEMBR. (kolagen) EPITEL 5 vrstev bek: bazální (1) kubické (2-3) + LC povrchové ploché (2)+N 43 D

Hodnocení endotelu mrtvé buňky: do 5% počet/mm 2 :  polymegatismus: odchylky ve velikosti pleomorfismus: odchylky od

9.TRANSPLANTACE diagnózy: keratokonus perforace roh. vředu bulózní keratopatie dystrofie (Fuchsova, makulární, PPCD) leukom rekeratoplastiky 8.UVOLNĚNÍ A DISTRIBUCE TKÁNĚ rizikové faktory: vaskularizace přítomnost srůstů glaukom, uveitida opakovaná KP velikost transplantátu inkomp. HLA, ABO diagnóza další chirurgie

9.TRANSPLANTACE rizika primární selhání infekce obnovení choroby rejekční reakce rejekce pomalá dekompenzace keratolýza výhody imunologické privilégium bez krevního a lymf. zás. nízký počet APC exprese (FasL) epitelem a endotelem transplantátu přítomnost TGF β v komorové tekutině molekuly s výraznými imunomodulačními účinky, ( α-MSH, VIP, somatostatin, trombospondin 1)

TSE, PRIONOVÁ ONEMOCNĚNÍ patolog.prion - protein, který přestal být proteinem (konformační změna) Creutzfeld-Jakobova choroba: c x nv Gerstmann-Sträussler-Scheinkerova choroba fatální familiární insomnie kuru normální prion PrP C x patol. PrP P (PrP SC, PrP BSE, PrP CJD ) PrP C PrP P konf. z.shlukování geneticky, spont. mutace, inokulace amyloid

Lidský amnion, HAM (human amnion membrane) vlastnosti podpora epitelizace  migrace,  adheze,  diferenciace,  apoptózy antiinfekční (inh. proteáz, MMP, cystatin E) inhibice fibrózy anatomická bariéra inhibice vaskularizace cytoprotektivní (hsp) použití defekty epitelu povrchu oka (Stevensův-Johnsonův sy, bulózní kertatopatie, nekrotizující keratitidy, OCP, poleptání, ulcerace rohovky....) rekonstrukce povrchu oka lokální terapie

Preparace HAM 1.oplach amnionu pufrem (odstranění krve) 2.nastřižení kolem pupečníku, tupá preparace amnionu 3.natažení amnionu na Petriho misku (epitelem nahoru) 4.oplach pufrem, vyhlazení AM 5.přenesení na NC membránu (epitelem nahoru) 6.vystřihání 2x2, 3x4cm čtverců 7.přenesení do skladovací nádobky -z placenty po císařském řezu -zpracování semisterilně - sterilně -odběr pupečníkové krve

Laboratoř Oční kliniky diagnosticko-léčebná syndrom suchého oka (kvalitativní) selhání limbálních kmenových buněk OCP příprava autologního séra dg.virových onemocnění výzkum molekulární a buněčné mechanismy rejekce allo i xenotransplantátů (zvířecí model) molekulární a buněčná charakterizace rohovkových dystrofií (PPCD) charakterizace hadovitého chromatinu METODY buněčné: mikroskopie, tkáňové kultury, imunohistochemie molekulární: PCR, elektroforéza, blotování, ISH

ZPRACOVÁNÍ A UCHOVÁVÁNÍ TKÁNÍ (rohovka, prstenec, spojivka, epiretinální membrána, komorová voda) zamrazování (-70°C) přímé zamrazování (KV)  stanovení proteinů v zamrazovacím médiu  krájení  vzorky IHC zalévání do parafínu  krájení  vzorky IHC zalévání do glutaraldehydu  vzorky pro ElMi

IMUNOHISTOCHEMIE Secundary

IMUNOHISTOCHEMIE OCP – IgA positivity in BM

OTISKOVÁ CYTOLOGIE SPOJIVKY (ROHOVKY) - jednoduchá, neinvazivní, netraumatizující metoda pro vyšetření povrchové vrstvy tkáně přilnavost povrchové vrstvy buněk na vhodný materiál zpracování vzorku (fixace, barvení) hodnocení Využití Screaning (pooperační změny, změny léčby) Diagnóza (selhání limbálních kmenových buněk)

Hodnocení squamózní metaplázie vrstevnatý sekr. n. nesekr. epitel  epitel nesekretující keratinizující, + abnormální diferenciace epitelu Stupeň 0:Normální spojivkový epitel Stupeň 1:Úbytek pohárk. buněk, bez keratinizace Stupeň 2:Ztráta pohárk. buněk, náznaky keratinizace Stupeň 3:Časná keratinizace Stupeň 4:Střední keratinizace Stupeň 5:Pokročilá keratinizace

Selhání limbálních kmenových buněk, LSCD Limbální kmenové bky: lokalizace: bazální vrstva epi limbu, pomalu dělící se bky, po stimulaci vysoká mitot. aktivita, posunují se z limbu do bazální vrstvy epitelu rohovky, stoupají do povrchových vrstev za současné diferenciace limbus – pozitivní negativní rohovka – negativní pozitivní CK 19 CK 3

vede k přerůstání spojivkového epitelu přes rohovku (nahrazení rohovkového epitelu spojivkovým)  povrchová vaskularizace rohovky, destrukce bazální membrány rohovky, chron. zánětlivá infiltrace Selhání limbálních kmenových buněk, LSCD rohovka povrchová vrstva epitelu spojivka