Cystická fibrosa

Cystická fibrosa závažná a chronicky progredující choroba dědičné-autosomálně recesivní (AR) onemocnění závažná a chronicky progredující choroba střední délka života 36,8 let Multiorgánové postižení: Dýchací cesty: hustý hlen vede k obstrukci dýchacích cest infekce a sekundární zánětlivý proces progresivní destrukce plic. Pankreas: pankreatická insuficience tuková a proteinová malabsorpci Játra: jaterní léze, fokální biliární cirhóza Intestinum: obstrukce střeva, Meconiový illeus (15-20% dětí) Reprodukční trakt: absence vas deferens, infertilita (95% mužů) - Kůže: malfunkce potních žláz, zvýšený obsah soli v potu

Příčina cystické fibrosy - mutace v genu CFTR - CFTR kóduje chloridový kanál: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – transport Cl- přes plasmatickou membránu epiteliáních buněk výstelky dýchacích cest a jiných žláz - cAMP regulovaný chloridový kanál R NBD1 NBD2 TM1 TM2 Cl- TM- transmembránové domény lumen cytoplasma NBD-nucleotid vázající domény (ATP) R-regulační doména (cAMPdep.)

Mutace CFTR genu mutace jsou germinální (ve všech buňkách jedince) somatické nebyly dosud popsány ancestrální povaha mutací přenášeny z generace na generaci mutace de novo – velmi vzácně distribuce mutací je populačně specifická

F508del nejčastější mutace v české populaci ~70% delece tří bází v exonu 10 výpadek methioninu 508 v proteinu R NBD1 NBD2 TM1 TM2 Cl- …E   N   I I F  G   V    S  Y   D…   …..GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT…. …..GAA AAT ATC ATT GGT GTT TCC TAT GAT…. …E   N   I I G   V    S  Y   D… 

Vyšetření mutace F508del Obecný primer (C) Normal specific primer (N) Mutation specific primer (M) M C TARGET SEQUENCE N

Vyšetření mutace F508del PCR Mix 0 obsahuje primer obecný a „normální“ PCR reakce probíhá ve dvou zkumavkách: PCR Mix 0 obsahuje primer obecný a „normální“ PCR Mix 1 obsahuje primer obecný a „mutovaný“ O/N O/M 1 2 Homozygot bez mutace Heterozygot přenašeč s mutací

Vyšetření mutace F508del STS gen (P3,4) – kontrola průběhu PCR CFTR gen (P0,2) – obecný primer – primer specifický na sekvenci bez mutace CFTR gen (P1,2) – obecný primer – primer specifický na sekvenci s mutací P C R M i x 1 NK DNA marker Pacient 1 2 3 + + + + - +

PCR protokol-vyšetření mutace ΔF508 Detekce mutace způsobující cystickou fibrózu v CFTR genu pomocí sekvenčně specifických primerů PCR Mix 0 / Mix 1: Voda 8,5µl Pufr 2,0µl dNTP mix 4,0µl Mg2+ (MgCl2) 2,0µl Primery M0 / M1 1,2µl DNA 2,0µl Taq polymeráza 0,4 µl (na ledu)