DNA diagnostika II.

(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA DNA DIAGNOSTIKA Diagnostika DNA (genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA Proteinů (genová exprese)

DNA izolace Základní kroky: Lýze buněk → uvolnění DNA do roztoku DNA DIAGNOSTIKA DNA diagnostika DNA izolace Základní kroky: Lýze buněk → uvolnění DNA do roztoku Odstranění proteinů Proteáza Adsorpce nebo extrakce Precipitace DNA ethanolem → odstranění nečistot Rozpuštění DNA ve vodě či v pufru

Základní metody DNA izolace DNA diagnostika Základní metody DNA izolace Extrakce fenol-chloroformem (rozdílná rozpustnost v roztocích) Vysolovací metoda (precipitace proteinů pomocí NaCl) Denaturace proteinů varem Adsorpční metoda (silikagelová membrána)

Čistota a koncentrace DNA DNA diagnostika Čistota a koncentrace DNA Spektrofotometrie absorpční maximum pro nukleové kyseliny 260 nm pro proteiny 280 nm → koncentrace DNA: při 260 nm → čistota DNA dána poměrem 260/280 nm Gelová elektroforéza s fluorescentními barvami (orientační) DNA s navázanými barvami se v gelu zviditelní Gel obsahuje vzorek a DNA standardu o známé koncentraci – porovnání světelných intensit

Gelová elektroforéza - separační metoda DNA diagnostika Gelová elektroforéza - separační metoda rozdělení fragmentů DNA (RNA, molekul proteinů) podle velikosti na principu pohybu nabitých molekul v elektrickém poli DNA obsahuje záporně nabité fosfátové skupiny → pohyb od katody (-) k anodě (+) Rychlost pohybu závisí na délce fragmentu nepřímo úměrně

Gel – síťovitá struktura polymerních molekul s póry DNA diagnostika Gel – síťovitá struktura polymerních molekul s póry agaróza x polyakrylamid Různá rozlišovací schopnost: polyakrylamid schopen rozlišit fragmenty DNA lišící se o jeden nukleotid agaróza rozdělí fragmenty lišící se min. 10ti nukleotidy (širší rozpětí – stovky párů bazí) Etidiumbromid – barva přidávaná do gelu Váže se do struktury DNA Po expozici UV excituje fotony (svítí)

Délka neznámých fragmentů je porovnávána s délkou fragmentů standardu DNA diagnostika Délka neznámých fragmentů je porovnávána s délkou fragmentů standardu

PCR (polymerázová řetězová reakce) DNA diagnostika PCR (polymerázová řetězová reakce) PRINCIP: namnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA Reakce probíhá v cyklech (30 – 40 cyklů) Každý cyklus má 3 kroky (změna teploty je řídící konstanta ovlivňující jednotlivé kroky) Základní komponenty PCR reakce DNA vzorek Pár primerů Volné nukleotidy (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) DNA polymeráza s pufrem

Primery Krátké oligonukleotidy (20 – 30 nukleotidů) DNA diagnostika Primery Krátké oligonukleotidy (20 – 30 nukleotidů) Přímý primer a zpětný primer – každý se váže na jedno vlákno DNA Jsou komplementární k sekvencím na 3´konci odpovídajícího řetězce Ohraničují cílovou oblast DNA, kterou chceme amplifikovat (namnožit) Nasednutí primerů ovlivňuje teplota anelační teplota – je dána délkou primerů a obsahem nukleotidů Tanneal.= [4x(G+C) + 2x(A+T) - 5]

cukr-fosfátová kostra

Kroky PCR Denaturace Annealing Extenze (elongace) DNA diagnostika Kroky PCR Denaturace porušení H-můstku v dvoušroubovici DNA za vzniku separátních vláken (T > 94°C) Annealing připojení primerů k odděleným vláknům DNA (Tanneal. = ?) Extenze (elongace) prodlužování, syntéza nového vlákna DNA pomocí DNA polymerázy podle starého vlákna jako templátu (T = 72°C)

DNA diagnostika

Amplifikace Exponenciální průběh DNA diagnostika Amplifikace Exponenciální průběh Počet kopií množeného úseku DNA = 2n, kde n je počet cyklů

„žebříček“ PCR fragmenty DNA diagnostika „žebříček“ PCR fragmenty

DNA diagnostika Typy PCR Nested PCR (zahrnuje dvě po sobě jdoucí PCR reakce) – cílená analýza Multiplex PCR (ve stejném čase probíhají dvě i více PCR reakcí najednou podle téhož templátu) – cílená analýza PCR se sekvenčně specifickými primery – cílená analýza PCR s obecnými primery – následuje analýza PCR produktu

Analýza PCR produktu (PCR s obecnými primery) DNA diagnostika Analýza PCR produktu (PCR s obecnými primery) Neznámá mutace – kompletní analýza Sekvenování hledání kompletního (přesného) pořadí nukleotidů v amplifikovaném úseku DNA Známá mutace – cílená analýza Hybridizace PCR produkt analyzujeme pomocí značené sondy RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) PCR produkt specificky naštěpíme pomocí restrikčních enzymů (restrikční endonukleáza – restriktáza)

Detekce exprese určitého genu Genová exprese na úrovni – mRNA – proteinů mRNA – Real-Time PCR, Northern blot Proteiny – Western blot X DNA analýza – Southern blot

Genová exprese na úrovni mRNA RNA diagnostika Genová exprese na úrovni mRNA Real-Time PCR → PCR i pro kvantitativní analýzu (x DNA diagnostika – kvalitativní analýza) Měříme narůstající množství PCR produktu v čase (kolik) – v každém cyklu PCR reakce Pokud není gen exprimován, mRNA nevzniká – nedochází k amplifikaci RNA cDNA (komplementární DNA) Čím více mRNA daného genu, tím více cDNA, tím rychleji se amplifikuje → gen je více exprimován (komparativní analýza) Reverzní transkripce Reverzní transkriptáza