Příklady na allosterii. 1) Pro histidinový zbytek v aktivním místě ATCasy se předpokládá, že stabilizuje tranzitní stav vázaného substrátu. Za předpokladu, že tato reakce je esenciální pro pH profil enzymu, určete jaký vliv na rychlost enzymové reakce bude mít změna pH ?

Odpověď na 10/1. Protonizovaná forma His pravděpodobně stabilizuje negativní náboj karbonylového kyslíku lehce štěpitelné vazby v přechodovém stavu. Deprotonizace může vést ke ztrátě aktivity. V tomto smyslu lze očekávat rychlost rovnou polovině maximální při pH 6, 5 (pK His bez náboje) a snížení při růstu pH.

2. Allosterický vypínač. Substrát se váže 100 x pevněji k R stavu allosterického enzymu, než k T stavu. Aplikujte symetrický model (MWC): A) Jakým faktorem se změní poměr koncentrací enzymových molekul v R a T stavech po vazbě jedné molekuly substrátu na enzymovou molekulu ? B) Předpokládejte, že L (poměr [T] ku [R]) za nepřítomnosti substrátu je a enzym má čtyři vazebná místa pro substrát. Jaký je poměr enzymových molekul ve stavu R a T za přítomnosti saturačního množství substrátu. Předpokládejte, že platí model MWC.

Odpověď 2/10. 2A) 100. Změna poměru [R] / [T] po vazbě jednoho substrátu musí být stejná jako poměr substrátových afinit těchto dvou forem. 2B) 10. Vazba čtyř substrátů mění poměr [R] / [T] faktorem = Poměr za nepřítomnosti substrátu je Z toho plyne, že při plné saturaci ligandovými molekulami je poměr 10 8 x = 10.

Allosterický přechod 10/3. Uvažujte allosterický protein, který se chová v intencích symetrického modelu. Poměr T ku R za nepřítomnosti ligandu je K T = 2 mM a K R = 5  M. Protein má čtyři vazebná místa pro ligand. Jaká je frakce molekul v R stavu, když jsou vázány 0, 1, 2, 3 a 4 ligandy ?

Odpověď 10/3. Frakce molekul v R stavu je ; 0, 004; 0, 615 a 0, 998 a 1, když jsou vázány 0, 1, 2, 3 a 4 ligandy.

Negativní kooperativita 10/4. Izolovali jste dimerní enzym obsahující dvě aktivní místa. Vazba jednoho substrátu do jednoho aktivního místa snižuje aktivitu druhého aktivního místa. Který allosterický model a proč zde můžeme uplatnit ?

Odpověď 10/4. Může být uplatněn pouze sekvenční model – symetrický ne.

Na první pohled paradox ?!? 10/5 Připomeňme si, že PALA (fosfonoacetyl-L-aspartát) je inhibitorem ATCasy, protože napodobuje dva fyziologické substráty. Avšak nízké koncentrace tohoto nereaktivního bisubstrátového analoga reakční rychlost zvyšují. Po přidání PALA k enzymu se reakční rychlost zvyšuje až do vazby tří molekul na molekulu enzymu. Tato rychlost je 17x vyšší než bez přítomnosti PALA. Reakční rychlost poté klesá až téměř k nule po přidání tří dalších molekul PALA k molekule enzymu. Proč nízké koncentrace PALA aktivují ATCasu ?

Odpověď 10/5 Vazba PALA přepíná ATCasu ze stavu T do stavu R, protože se jedná o substrátový analog. Enzymová molekula obsahující vázané PALA mé méně volných katalytických míst než volný enzym. Avšak enzym s vázaným PALA bude v R stavu a proto má vyšší afinitu k substrátům. Závislost stupně aktivace na koncentraci PALA je komplexní funkcí allosterické konstanty L o a vazebných afinit R a T stavů k substrátovým analogům a substrátům.

R versus T 10/6 Allosterický enzym, který splňuje symetrický model má T / R poměr 300 za nepřítomnosti substrátu. Uvažujte, že lze mutací obrátit tento poměr. Jaký má tato mutace vliv na poměr mezi rychlostí reakce a koncentrací substrátu ?

Odpověď 10/6. Zaznamenáme jednoduchou Michaelis- Mentenovskou kinetiku, protože se bude jednat pouze o stav R.

Ladění afinity kyslíku. 10/7 Jaký vliv na afinitu kyslíku k hemoglobinu mají následující změny in vitro ? A) Zvýšení pH ze 7, 2 na 7, 4. B) Zvýšení pCO 2 z 10 na 100 Torrů. C) Zvýšení [2, 3 – BPG] z 0, 0002 na 0, 0008 M. D) Disociace a 2 b 2 na monomerní podjednotky.

Odpověď 10/7 A) Zvýšení. B) Snížení C) Snížení D) Zvýšená afinita kyslíku.

Ptačí a plazí protiklad 10/8. Želví a ptačí erythrocyty obsahují jinou regulační molekulu než 2, 3 – BPG. Která z následujících sloučenin může v této funkci 2, 3 – BPG zastoupit ? Tato látka se také využívá při transfůzi. A) Glukosa-6-fosfát. B)Inositolhexafosfát C) HPO 4 2- D) Malonát E) Arginin F) Laktát

Odpověď 10/8. Inositolhexafosfát.

Modifikace ATCasy 10/17 ATCasa reagovala s nitromethanem za vzniku barevného nitrotyrosinového derivátu v každém z katalytických řetězců (l max = 430 nm). Absorbance této indikační skupiny závisí na prostředí. Taktéž esenciální Lys zbytek v každém aktivním místě enzymu byl modifikován, aby nedošlo k vazbě substrátu. Katalytické trimery tohoto dvakrát modifikovaného enzymu byly poté kombinovány s nativními trimery za vzniku hybridního enzymu. Absorbance nitrotyrosinové skupiny hybridního enzymu byla měřena po přidání sukcinátu jako substrátového analoga. Jaký je význam změny absorbance při 430 nm ? Vazba sukcinátu, nereaktivního analoga aspartátu, k jednomu trimeru mění viditelné absorpční spektrum nitrotyrosinových míst připojených na druhý trimer.

Podle H. K. Schachman. J. Biol. Chem. 263 (1988),

Odpověď 10/17. Vazba sukcinátu do funkčních aktivních míst nativní části c 3 mění viditelné absorpční spektrum nitrotyrosinového místa v druhé části c 3 hybridního enzymu. To znamená, že vazba substrátového analoga na jeden trimer mění strukturu druhého trimeru.

Modifikace ATCasy 2.(10/18). Konstrukce jiného hybridu ATCasy za účelem studia allosterických inhibitorů a aktivátorů. Normální regulační podjednotky byly kombinovány s nitrotyrosinovými podjednotkami. Přídavek ATP bez substrátu zvyšuje absorbanci při 430 nm, což je shodné s přídavkem sukcinátu. Naopak přídavek CTP bez substrátu snižuje absorbanci při 430 nm. Jaký je význam změny absorbance indikačních skupin při 430 nm ?

Podle H. K. Schachman. J. Biol. Chem. 263 (1988),

Odpověď 10/18. Podle symetrického modelu, allosterický aktivátor posunuje konformační rovnováhu všech podjednotek do R stavu, zatímco allosterický inhibitor posunuje do T stavu. Proto ATP (aktivátor) posunuje rovnováhu k R stavu, což způsobuje stejné změny jako by byl vázán substrát. CTP (inhibitor) má jiný efekt. Posunuje rovnováhu do T stavu.