Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012

► stále obvykle není reálné osekvenovat a projít celý eukar. genom a najít (relativně vzácné) SSR lokusy Jak najít v genomu SSR? ► účinnější je sekvenovat úseky kde se dá předpokládat vyšší výskyt SSR → snaha o vytvoření ´SSR-enriched genomic library´ ► sekvenací fragmentů DNA genom. library

1.štěpení genom. DNA na fragmenty, jejich úprava aby šly použít pro běžné molek. metody - PCR amplifikace a sekvenace (~ bp) Vytvoření SSR-enriched genomic library 3.výsledné fragmenty jsou sekvenovány, na základě získaných sekvencí navrženy primery pro daný SSR lokus 2.SSR enrichment: pomocí sondy komplementární k určitému SSR motivu se vytáhnou fragmenty obsahující daný SSR motiv

1.štěpení genom. DNA ► blunt-ends; 16 h inkubace, pak purifikace (PCR Clean-up kit) + restr. enzym + T4 ligáza, linkery Vytvoření SSR-enriched genomic library dimery linkerů → ← OK ► ligace: na konce fragmentů navázány ligací krátké dsDNA fragmenty (linkery) s arbitrární sekvencí - umožní pozdější PCR amplifikaci a sekvenaci; 20 h inkubace ► ověření úspěšnosti ligace: PCR, linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear bez proužku dimerů linkerů

2.SSR-enrichment - hybridizace: ► na fragmenty se annealuje sonda (primer) se SSR motivem, která je na 5´ konci značená biotinem; ca 60° - 15 h teplotní denaturace + sonda Vytvoření SSR-enriched genomic library

2.SSR-enrichment – streptavidin capture, wash: ► ke směsi se přidají streptavidin-coated magnetic beads: vážou biotin a navázáním na sondu z roztoku vychytají fragmenty které nesou daný SSR motiv separace magnetem + roztok streptavidin-coated beads odsátí roztoku Vytvoření SSR-enriched genomic library ► magnetické kuličky s cílovými fragmenty se separují pomocí magnet. stojánku, promývají a supernatant se odstraní ► cílové DNA fragmenty se uvolní TE pufrem (95°), pomnoží pomocí PCR: linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear fragmentů bp → a zpurifikují PCR Clean-Up kitem

a)klasická sekvenace (Sanger):  umožňuje sekvenaci pouze u směsi homogenních molekul  knihovnu nutné nejdříve amplifikovat pomocí PCR – primery nasedají na linkery naligované na koncích fragmentů  PCR produkt klonován, aby se separovaly jednotlivé molekuly PCR produktu, a klony potom sekvenovány – finančně extrémně náročné!  obvykle pouze 5-10% fragmentů opravdu nese SSR!!!  př.: nutné sekvenovat ca klonů pro získání 10 SSR lokusů = tis. Kč  možná úspora: selekce klonů pomocí Southern blottu – jako sonda použitý opět daný SSR motiv; sekvenovány pouze klony u nichž blotting opravdu prokáže přítomnost SSR Co dál s SSR-enriched genomic library?

b)454 pyrosequencing  umožňuje i sekvenaci směsi heterogenních molekul (není nutné klonování) 1 molecule → 1 sequencing read 1 sample: min. 5,000-8,000 seq. reads / 2500 Kč (vlastní cena chemikálií, u komerčních firem několikrát víc)  nevýhody:  kratší délka 454 sekvencí (<550 bp) → riziko že se nepodaří najít vhodná místa pro primery → redukuje počet reálných SSR lokusů  minimální cena 1 runu je ca 30 tis. Kč (= vyplatí se multiplexovat víc vzorků, v jednom runu možné kombinovat až 12 vz., tj. náklady na 1 vzorek ca 2500 Kč) Co dál s SSR-enriched genomic library?

Mikrosat. praktika,  restrikce genomové DNA  ligace adaptorů  hybridizace daného SSR motivu (motivů)  amplifikace a purifikace enriched SSR library Praktika 454 sekvenování na GS Junior (Roche/454), ~ konec května:  sekvenace vytvořené SSR library, 2 dny pipetování (+ 3. den stažení dat z přístroje)