Biochemie myokardu, biochemie plic Jana Novotná Ústav lékařské chemie a biochemie 2. LF UK

Specifičnost metabolismu myokardu Srdce je jedním z nejaktivnějších orgánů v těle. Funkce myokardu závisí na velmi jemné rovnováze mezi srdeční prací a energií, kterou musí myokard získat ze syntetických reakcí, které převádí do energeticky bohaté fosfátové vazby. Udržuje se tak plynulá návaznost mezi excitací a kontrakcí.

Specifičnost metabolismu myokardu Vysoká spotřeba kyslíku. Pro zachování vysokého srdečního výkonu je metabolismus uzpůsoben tak, aby oxidativní fosforylací produkoval maximální množství ATP. Za bazálních aerobních podmínek: 60% energie pochází z volných mastných kyselin a triglyceridů, 35% ze sacharidů, 5% z aminokyselin a ketolátek.

Specifičnost metabolismu myokardu Mitochondriální dýchací řetězec produkuje více než 90% energie. Mitochondrie zaujímají v kardiomyocytu ~30% celkového prostoru. > 95% ATP pochází z oxidativní fosforylace v mitochondriích. ~ 60 - 70% ATP se hydrolyzuje při svalové kontrakci ~ 30 - 40% ATP spotřebují Ca2+-ATPasa v sarkoplas-matickém retikulu a ostatní iontové pumpy.

Regulace metabolických drah v myokardu W.C. Stanley et all. Physiol. Rev. 85, 2005

Metabolismus sacharidů Zdravé srdce - ~ 60 - 90% acetyl-CoA pochází z b-oxidace, 10 – 40% z glykolýzy. Zdravé srdce metabolizuje laktát – jen v případě téměř maximálního výkonu nebo za ischemie (zrychlení glykolýzy v důsledku nedostatečné oxidace pyruvátu). transport laktátu do myocytu pomocí transportéru pro monokarboxylové kyseliny (MCT-1) Substráty pro glykolytickou dráhu (glukosa a glykogen) pocházejí z exogenních zdrojů.

Metabolismus sacharidů Transport glukosy do buňky srdečního svalu je regulován transmembránovým glukosovým gradientem a množstvím glukosových transportérů v sarkolemě – GLUT-4 (v menší míře GLUT-1). Glukosové tarnsportéry se přemisťují z intracelulárních vesikulů do sarkolemy – stimuluje insulin, zvýšená srdeční práce, ischémie. Hotovost glykogenu v srdeční svalovině ~30 mmol/g vlhké tkáně. Hotovost glykogenu v kosterní svalovině ~150 mmol/g vlhké tkáně.

Metabolismus sacharidů Stimulace insulinem, zvyšující se srdeční práce, ischémie   transport glukosy do buněk, rychlost jejího vychytávání. V glykolytické dráze se glukosa 6-fosfát a NAD+ přeměňuje na pyruvát a NADH. Vzniknou 2 ATP / 1 molekulu glukosy. Pyruvát a NADH se převedou do mitochondriální matrix  tvorba CO2 a NAD+ - kompletní aerobní oxidativní glykolýza  36 ATP/ /1 molekulu glukosy. http://www.nature.com/nrc/journal/v4/n11/fig_tab/nrc1478_F1.html

Metabolismus sacharidů http://themedicalbiochemistrypage.org/

Metabolismus sacharidů Fosfofruktokinasa-1 (PFK-1) – klíčový regulační enzym glykolýzy – katalýza ireverzibilního kroku  tvorba fruktosa 1,6-bisfosfátu (F1,6BP) za spotřeby 1 ATP. PFK-1 je aktivována ADP, AMP a Pi, inhibována ATP a poklesem pH (míra inhibice [H+] závisí na hladině ATP). PFK-1 stimuluje také fruktosa 2,6-bisfosfát (F2,6PB) F2,6BP je tvořen z fruktosa 6-fosfátu bifunkčním enzymem fosfofrukto-2-kinasou/fruktosa-2,6-bisfotatasou (PFK-2). F2,6BP zvyšuje afinitu PFK-1 k F6P W.C. Stanley et all. Physiol. Rev. 85, 2005

Metabolismus sacharidů Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa (GAPDH) přeměna glyceraldehyd-3-fosfátu na 1,3-difosfoglycerát za vzniku NADH+H+. GAPDH – jeden z hlavních regulačních mechanismů → inhibice zvýšenou konc. NADH+H+ v cytoplasmě a aktivace zvýšenou konc. NAD+. Při ischémii dochází k akumulaci NADH+H+ a laktátu v cytoplasmě a tím k inhibici GAPDH. Enzymy glykolýzy – lokalizace kolem sarkoplasmatického retikula a sarkolemy, jen asi 10% glykolýzy probíhá v cytoplasmě.

Metabolismus sacharidů pyruvát v mitochondrii: dekarboxylace a oxidace pyruvátdehydrogenasou (PDH) na acetyl CoA, nebo karboxylace pyruvátkarboxylasou na oxalacetát, případně redukce na laktát. Regulace aktivity PDH je zásadní pro řízení celého glukosového metabolismu. Adrenergní stimulace  Ca2+ v cytosolu a v mitochondriích  aktivace PDH oxidace pyruvátu  zvýší se srdeční činnost. Zvýšená rychlost oxidace mastných kyselin PDH inhibuje, tím se snižuje oxidace glukosy a pyruvátu.

Metabolismus laktátu Za anaerobních podmínek (ischémie) se pyruvát redukuje na laktát – anaerobní glykolýza. Laktát se uvolňuje přes specifický transportér MCT do krve. MCT má zásadní význam pro regulaci a udržování intracelulárního pH (odstraňuje také protony vzniklé během glykolýzy). Během hladovění se laktát mění zpět na pyruvát. Při oxidaci laktátu na pyruvát se NAD+ redukuje na NADH a vzniknou 3 ATP → pyruvát se aerobně metabolizuje v citrátovém cyklu za vzniku 14 ATP.

Metabolismus mastných kyselin Volné mastné kyseliny vstupují do buňky srdečního svalu: pasivní difúsí proteinem zprostředkovaným transportem přes sarkolemu – translokázou mastných kyselin FAT nebo proteinem vázajícím mastné kyseliny, FABPpm. Syntasa acyl-CoA mastných kyselin (fatty acyl-CoA synthase, FACS) esterifikuje volné mastné kyseliny na acyl-CoA. W.C. Stanley et all. Physiol. Rev. 85, 2005

Metabolismus mastných kyselin Osud acyl-CoA dlouhých mastných kyselin: esterifikace na triglyceridy (glycerolfosfátacyltransferasou)  intrakardiální hotovost triglyceridů (10-30% of FA) nebo vazba na karnitin  acylkarnitin dlouhých mastných kyselin  přenos mezi vnější a vnitřní mitochondriální membránu karnitin- palmitoyltransferasou-I (CPT-I) W.C. Stanley et all. Physiol. Rev. 85, 2005

Metabolismus mastných kyselin Karnitinacyltranslokasa (CAT)  transport acylkarnitinu dlouhých mastných kyselin přes vnitřní membránu do matrix mitochondrie za volný karnitin. Karnitinpalmitoyltransferasa II (CPT-II) regeneruje acylkarnitin dlouhých mastných kyselin na volný acyl-CoA. W.C. Stanley et all. Physiol. Rev. 85, 2005

Metabolismus mastných kyselin Malonyl-CoA - klíčový fysiologický regulátor oxidace mastných kyselin v srdci ( malonyl-CoA  vychytávání MK a jejich oxidaci). Malonyl-CoA velmi silně inhibuje CPT-I (na cytosolické starně). CPT-I má dvě izoformy: jaterní CPT-1a a CPT-Tb v srdci CPT-1b je 30krát více senzitivní k inhibici malonylem-CoA. W.C. Stanley et all. Physiol. Rev. 85, 2005

Vzájemná regulace mezi oxidací mastných kyselin a metabolismem sacharidů Hlavní fysiologický regulační mechanismus toku a rychlosti oxidace glukosy přes PDH v srdci je oxidace mastných kyselin. Aktivitu PDH inhibuje vysoká rychlost oxidace mastných kyselin přes zvýšení poměru mitochondriální acetyl-CoA/volný CoA a NADH/NAD+ což aktivuje PDH kinasu.

Vzájemná regulace mezi oxidací mastných kyselin a metabolismem sacharidů Inhibice oxidace mastných kyselin zvyšuje absorpci glukosy a laktátu a jejich oxidaci:

Metabolismus ketolátek Srdce během hladovění nebo špatně léčeného diabetu využívá a oxiduje ketolátky (b-hydroxybutyrát a acetoacetát). Málo insulinu a vysoká hladina mastných kyselin  ketolátky. Ketolátky jsou pak pro srdce hlavním substrátem. Ketolátky inhibují PDH a b-oxidaci.

Srdeční sval a ischémie Okluse koronární artérie  ischémie  výrazná změna struktury buněk, chemismu a jejich funkcí ztráta kontraktilní funkce arytmie smrt buněk Pokles poměru ATP/ADP, hromadění AMP, Pi, produkty metabolismu nejsou odstraňovány (laktát). Rychlý pokles kreatinfosfátu – kreatinkinasa + ADP → fosforylace ADP → ATP (jen krátkodobý mechanismus, nekompenzuje sníženou produkci ATP v mitochondriích)

Srdeční sval a ischémie Již mírná ischémie snižuje koncentraci ATP a kreatinfosfátu, zvyšuje hladinu anorganického fosfátu → aktivace glykolýzy (potřeba glukosy z krevního řečiště do srdečních buněk) → zvýšení koncentrace pyruvátu → přeměna LDH na laktát. Delší ischémie – hromadění substrátů (latát, NADH+ a H+) → zpomalení glykolýzy na úrovni fosfofruktokinasy a glyceraldehyd-3-dehydrogenasy.

Biochemické markery poškození srdečního svalu Troponin (T or I) - nejcitlivější a nejspecifičtější marker poškození myokardu. Uvolnění během IM z cytosolu myocytů. Dosažení vrcholu přibližně za 12 hodin po IM.

Biochemické markery poškození srdečního svalu Kreatin kinasa (CK) je relativně specifický marker, pokud není poškozen kosterní sval CK má dvě podjednotky – CK-M (muscle), CK-B (brain) a mitochondriální CKmi CK-MM (CK-1) - kosterní sval 95%, srdce 42%, hladký sval 2 – 3% CK-MB (CK2) – kosterní sval 3%, srdce 28%, hladký sval 1 – 5% CK-BB (CK-3) – kosterní sval 1%, srdce 1%, hladký sval 87% Vrcholu dosahuje přibližně mezi 10 – 24 hod.

Biochemické markery poškození srdečního svalu Laktátdehydrogenasa (10 – 24 hod.) není tak specifická jako troponin tetramer, 2 podjednotky – H – srdeční, M - svalová Izoenzymy LDH1 (4 H) – srdce a erytrocyty LDH2 (3HM) – srdce a retikuloendoteliální systém, LDH3 (2H2M) - plíce, LDH4 (H3M) – ledviny, placenta, pankreas, LDH5 (4M) – játra a příčně pruhovaný sval V normoxii je vyšší hladina LD2 než LD1 Akutní srdeční infart – mezi 6 a 12 hodinou po uzávěrce koronární – LD1 vyšší než LD2 Myoglobin – vzestup velmi rychle (asi 2 hodiny) – nízká specifita poškození myokardu

Biochemické markery poškození srdečního svalu Aspartáttransaminasa (AST) Byla použita jako první pro detekci poškození myokardu Používá se také pro testování jaterní funkce. Izoenzym glykogenfosforylasy BB (GPBB) jedna ze 3 izoforem glykogenfosforylasy, které se nacházejí v srdci a mozkové tkáni. Izoenzym z mozkové tkáně neprochází přes hematoencefalickou bariéru, proto je pro srdeční tkáň GP-BB specifická. Jeden z „nových markerů srdečního poškození", diskutován, zda je jeho použití vhodné ke zlepšení včasné diagnózy v akutního koronárního syndromu. Zvyšuje se 1–3 hodiny po vzniku ischemie.

Literatura Reviews: W.C. Stanley, F.A. Recchia, G.D. Lopaschuk: Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol. Rev. 85:1093-1129, 2005 CH. Depré, M.H. Rider, L. Hue: Mechanism of control of heart glycolysis. Eur. J. Biochem. 258:277-290, 1998 R. Ventura-Clapier, A. Garnier, V. Veksler: Energy metabolism in heart failure. J. Physiol. 555:1-13, 2003

BIOCHEMIE PLIC

PLÍCE Produkují: surfaktant Inaktivují: ROS Aktivují: angiotensin kolagen + elastin hlen (mukolpolysacharidy + IgA) Inaktivují: ROS kininy – (hydrolýza peptidové vazby u bradykininu kininasou II) serotonin – (z oběhu aktivním transportem přes endotelium, rychlé odbourávání MAO, žírné buňky) noradrenalin acetylcholin detoxikace cizorodých látek (vdechovaných i z cirkulace) hydroxylací cytochromem P450 v mikrosomech Aktivují: angiotensin

Intermediární metabolismus plic Primární fyziologická role plic – udržovat intermediární metabolismus orgánů - O2, CO2 O2 a jeho využití: stejný jako u jiných orgánů – mitochondriální cytochromoxidasa → redukce kyslíku na H2O a produkci ATP různé oxidasy se smíšenou funkcí a transferasy přenášející O2. významná funkce - hydroxylace xenobiotik a endogenních substrátů jako mastné kyseliny pomocí cytochromu P450 v endoplasmatickém retikulu.

Intermediární metabolismus plic Významné dráhy dependentní na O2 syntéza eikosanoidů (lipoxygenasa a cykloxygenasa), hydroxylace prolinu a lysinu (prolyl a lysylhydroxylasa) pro pojivovou tkáň, oxidace aminů jako 5-hydroxytriptamin, noradrenalin (MAO a aldehydoxidasa), respirační vzplanutí (NADPH-oxidasa – makrofágy, neutrofily), oxidace hypoxanthinu (xanthinoxidasa), různé reakce v peroxisomech (urátoxidasa).

Intermediární metabolismus plic Glukosa Hlavní substrát, uhlíková kostra se přemění: 20% na CO2 → z toho 75% produkce CO2 z mitochondriální dekarboxylace pyruvátu a z TCA, 25% pentosové dráhy 30% inkoporace do proteinů, nukleových kyselin, glykogenu a dalších makromolekul (18%), polysacharidy (5%) zbytek ~ 50% se odvádí jako laktát (43%), pyruvát (5%).

Intermediární metabolismus plic Proč je tak relativně velká produkce laktátu? Proč je omezená dráha TCA? V plicích je víc buněk, které mají málo mitochondrií nebo některé mitochondriální enzymy chybí.

Intermediární metabolismus plic Využití dalších substrátů: fruktosa – jako alternativní hexosa laktát → pyruvát glycerol → přeměna na glycerol-3-fosfát (glycerol kinasa) mastné kyseliny (palmitát) – biosyntéza komplexních lipidů, ale mohou být metabolizovány až na CO2

Intermediární metabolismus plic Tvorba redukujících ekvivalentů NADH gykolýza (1,3-bisfosfoglycerát → glyceraldehyd-3-fosfát), reakce pyruvátdehydrogenasy, TCA. NADPH pentosofosfátová dráha - glukosa-6-fosfátdehydrogenasa (glukosa-6-fosfát → 6-fosfoglukonlakton) a 6-fosfo-glukonátdehydrogenasa (6-fosfogluklonát → ribulosa-5-fosfát). NADH a NADPH – využití v biosyntetických dráhách, NADPH jako kofaktor glutathionreduktasy při oxidačním stresu.

Surfaktant Lipoproteinový komplex snižující povrchové napětí – syntéza alveolárními epitelovými buňkami typu II Hydrofilní a hydrofobní složka Hydrofilní složka směřuje dovnitř alveolu (extracelulární tekutina), hydrofobní vně (vzduch)

Složení surfaktantu Lyra, P.P.R; de Albuquerque Diniz, E.M. Clinics 62: 181, 2007

Alveolus http://herkules.oulu.fi/isbn9514270584/html/c273.html

Fosfolipidy Nepolární část Polární hlava

Proteiny Syntéza – epiteliální buňky SP-A a SP-D velké glykosylované proteiny ( SP-D má 355 AK) ve vodě rozpustné kolektiny, kalcium-dependentní, vázající cukry SP-B a SP-C malé peptidy (35 AK), vysoce hydrofobní schopnost snižovat povrchové napětí důležité pro rozprostření surfaktantu na povrchu alveolu

Proteiny SP-A : SP-D důležitá role v obraně proti patogenům tvorba tubulárního myelinu regulace vestavby fosfolipidů do monomolekulární vrstvy modulace absorpce a sekrece fosfolipidů buňkami typu II aktivace alveolárních makrofágů vazba a odstraňování bakterií a virů chemotaktická stimulace alveolárních makrofágů SP-D důležitá role v obraně proti patogenům SP-B a SP-C: zvyšování biofyzikálních vlastností surfaktantu podpora rychlého zabudování a molekulární rozvrstvení fosfolipidů v monomolekulární vrstvě

Metabolismus surfaktantu DPPC je syntetizován rER přenesen do lamelárních tělísek spolu s SP-B a SP-C lamelární tělíska jsou zásobní a sekreční granula obklopená membránou fusují s plasmatickou membránou a vzniká tubulární myelin napínáním a kontrakcemi během respiračního cyklu se část TM desorganizuje, reabsorbuje a recykluje, malá část se katabolizuje. Lyra, P.P.R; de Albuquerque Diniz, E.M. Clinics 62: 181, 2007

Lamelární tělíska a tubulární myelin Lamelární tělíska mají kyselé vnitřní prostředí a mají vysoký obsah vápníku. V alveolárním prostoru se transformují na trojrozměrnou síť - tubulární myelin. TM obsahuje asi ½ obsahu všech fosfolipidů v alveolu.

Vlastnosti surfaktantu Jakmile je vyloučen do alveolárního prostoru, rychle vytvoří fosfolipidový film mezi vodnou fází a vzduchem (u novorozenců po prvním nadechnutí). Snižuje povrchové napětí, když dojde při výdechu, k jeho stlačení (plíce nekolabují). Proteiny surfaktantu působí jako obrana proti patogenům (rozpoznání a opsonizace bakteriálních, houbových, virových povrchových oligosacharidů).

Regulace tvorby surfaktantu napnutí alveolární stěny hyperventilace - hluboké dechy, zívání acetylcholin beta-agonisté kortikoidy - zralost novorozenců tyroxin

Syntéza plicních lipidů Substráty pro syntézu de novo glukóza a glykogen glycerol-3-fosfát cholin, etanolamin, inositol polární hlavy mastné kyseliny exogenní mastné kyseliny endogenní z laktátu

Syntéza DPPC de novo Glukosa Glykogen DHAP glycerol-3-fosfát cholin palmitoyl-G3P dipalmitoylfosfatidová kyselina dypalmitoylglycerol DPPC cholin fosfocholin CDP-cholin palmitoyl-CoA CoASH H2O Pi ATP ADP CTP PPi CMP Glukosa Glykogen DHAP NAD+ NADH

Reaktivní formy kyslíku (ROS) HO2 . O2 + e + H+ hydroperoxidový radikál H+ + O2- . HO2 . superoxidový radikál O2- + 2H+ + e . peroxid vodíku H2O2 OH- + OH . H2O2 + e hydroxylový radikál OH + e + H+ . H2O

Zdroje ROS v buňce Fentonova reakce Superoxid se v buňce tvoří ve značném množství – cytosol a mitochondrie (hlavně z elektronů, které unikly z mitochondrie z dýchacího řetězce). Dvě molekuly O2- rychle dismutují na O2 a H2O2. H2O2 neustále proudí mezi buněčnými kompartmenty jako zdroj ROS. Endogenní zdroje ROS: O3, NO, NOx, SiO2, kouření, infekce, radiace, hypoxie/reoxygenace, ischemie/reperfuse. .

Reaktivní formy dusíku (RNS) L-arginin NOS II L-citrulin + NO HbO2 O2 O2- NO3- + metHb NO2- HOCl + MPO ONOOH oxidace nitrace nitrosace thilylový radikál S-nitrosothiol nitrotyrosin

Antioxidační ochrana Enzymy vychytávající volné radikály Součásti antioxidační ochrany

Ochrana proti ROS Neenzymatická: nízkomolekulární scavengery vitamin E - lipoperoxidy vitamin C - O2-, .OH , Fe3+ Fe2+ β-karoten (O2-), kys. močová (O2-), glukóza (OH), bilirubin (LOO.) Sekvestrace redoxně aktivních kovů (Fe) (bezpečná vazba) transferin, feritin, ceruloplasmin, haptoglobin, laktoferin Plíce: nitrobuněčné enzymy, tekutina lemující epiteliální buňky (GSH 100x vyšší než v plazmě, kataláza, SOD, GPx)

Kolagen 90% tvoří kolagen I a III Intersticium – kol I, III, V, VI bronchy – kol II cévy – kol I, III, VIII bazální membrány – kol IV, V Syntéza + depozice Degradace fibróza emfyzém

Degradace Specifické enzymy – matrixové metaloproteinasy (MMP´s) Intersticiální kolagenasa, želatinasy, stromelysyn MMP´s inhibují specifické tkáňové inhibitory (TIMP´s)