chromatografické metody adsorpce - fyzikální, chemická Chromatografie chromatografické metody adsorpce - fyzikální, chemická

chromatografie - soubor metod sloužících k oddělování a analýze složek ze směsí rozdělení směsi bílkovin rozdělení listových barviv rozdělení reaktantů po reakci (produkty odbourávání pesticidů) lze rozdělovat velmi podobné sloučeniny (proteiny lišící se jednou aminokyselinou) chromatografie - citlivá metoda, nepoškozuje dělený materiál

složky směsi rozdělovány mezi dvě fáze: stacionární fáze mobilní fáze = eluční činidlo složky s větší afinitou k mobilní fázi postupují rychleji než složky s větší afinitou ke stacionární fázi stacionární fáze: náplň kolony tenká vrstva speciální papír mobilní fáze: směs rozpouštědel - kapalinová chromatografie plyn - plynová chromatografie

základní část chromatografické sestavy: kolona kolona: skleněná , kovová rozměry - podle aplikace na koloně probíhá vlastní separace složek

Základní operace: nástřik vzorku do mobilní fáze - ručně, pumpou (nastřikované objemy: ml, HPLC - 20 ml) separace komponent směsi na koloně postupná eluce komponent z kolony detekce složek v eluátu - kontinuální nebo ve frakcích (absorbance UV, VIS; vodivost; index lomu)

závislost detekované veličiny na čase nebo na elučním objemu - chromatogram plocha píků - úměrná koncentraci kvalitativní analýza - pomocí standarů

typy chromatografie podle principu (podle interakcí zodpovědných za dělení složek): adsorpční chromatografie rozdělovací chromatografie gelová chromatografie ionexová chromatografie afinitní chromatografie “chelátová chromatografie” - chromatografie využívající tvorby komplexů

adsorpční chromatografie: nejstarší chromatografie (Michail Semjonovič Cvět - 1903) dělení na základě rozdílné pevnosti fyzikální sorpce na pevnou fázi mobilní fáze: kapalina nebo plyn stacionární fáze: polární (Al2O3, silikagel) nepolární (aktivní uhlí)

rozdělovací chromatografie: stacionární i mobilní fáze kapalná stacionární fáze zakotvena na nosiči dělení na základě Nernstova rozdělovacího koeficientu papírová chromatografie: nosič = chromatografický papír stacionární fáze = voda (vzdušná vlhkost) mobilní fáze = směr organických rozpouštědel s vodou nemísitelných

gelová chromatografie: látky se dělí podle velikosti částic (molekul) stacionární fáze: gel s póry do určité velikosti velké molekuly se do pórů nevejdou, nejsou bržděny v pohybu čím menší molekuly, tím více pórů, kam mohou zapadat - tím větší zpožďování

směs molekul tří velikostí zrnko gelu s póry dělení na zrnkách gelu tvořících stacionární fázi rozdělená směs, velké molekuly vytékají jako první

ionexová chromatografie (iontově výměnná): separuje molekuly podle náboje stacionární fáze: iontoměnič nabitými skupinami anex - schopen vázat a vyměňovat anionty (obsahuje kladně nabité skupiny) katex - schopen vázat a vyměňovat kationty (obsahuje záporně nabité skupiny)

v elučním činidle 1 navázány ionty na iontoměnič (anex) elučním činidlem B - postupné uvolňování navázaných aniontů podle velikosti náboje

povaha matrice určuje fyzikální vlastnosti ionex mechanickou pevnost rychlost průtoku chování k biologickým sloučeninám

první iontoměniče - určeny pro aplikace související s úpravou vody (demineralizace, úprava vody na pitnou, “recovery” iontů z odpadů) pro takové účely: syntetické iontoměniče, matrice = hodně zesíťovaný hydrofobní polymer (vysoká kapacita pro malé ionty) pro biologické polymery - pŕy malé pro průchod, denaturace pro biologické materiály - celulosové měniče (hydrofilní) AE celulosa DEAE celulosa nedenaturují bílkoviny, ale dovolují jen malé průtoky a mají nízkou nábojovou kapacitu (jinak by se celulosa rozustila )

afinitní chromatografie: metoda k dělení biologických molekul, využívá specifických interakcí mezi dělenými molekulami a molekulami zakotvenými na nosiči potřebujem 2 eluční činidla: jedno k navázání složky s afinitou, druhé pro její eluci z kolony

silné navázání - více vazezebných interakcí slabé navázání - málo vazebných interakcí žádná vazba - nemůže tvořit interakce s molekulou kovalentně vázanou na nosiči eluce: první odcházejí nejslaběji vázané složky poslední vytékají nejsilněji interagující složky

chromatografie využívající tvorby komplexů: v proteinech - aminokyseliny schopné tvořit komplexy (histidin, cystein, tryptofan) na matrici nosiče navázány kovy tvořící komplexy než se v systému objeví protein, je koordinační sféra vysycena molekulami vody dvě eluční činidla: A: pro nanesení vzorku a vymytí nekomplexujících složek B: pro eluci oddělených složek z kolony

plynová chromatografie: každá chromatografie, kde mobilní fází je plyn (gas chromatography- GC) kapalinová chromatografie: každá chromatografie, kde mobilní fází je kapalice (liquid chromatography - LC)

HPLC - High Performance Liquid Chromatography kolony: speciální náplně (jemné, stejná velikost zrn) práce za vysokého tlaku (až 600 atm) dávkování: cca 10 - 50 ml GC - MS, HPLC – MS (MS – mass spectrometry)

MS – princip metody 1. ionizace elektrony o E = 70kV ABCD + e- → ABCD+ + 2 e- 2. fragmentace: ABCD+ AB + CD+ AB+ + CD ACD+ + B 3. separace (v magnetickém a elektrickém poli) odchýlení podle m/z