Seminář UNCE 28.5.2012 UNIVERZITNÍ CENTRUM „Experimentální patologie založená na genové manipulaci kmenových buněk“ 4 cíle 4 senioři/14 juniorů UNCE 204021

Rozpočet Celkem 23,427 mil Kč (2012-2017) Podpora (2012) : 3,3645 mil Kč Dominantní složkou je mzdový fond Rok 2012 : provozní náklady (175 tis Kč) kryjí náklady z Centra biomodelů Projekt komplementuje PRVOUK, jež zajišťuje další prostředky pro platy a provoz. V neposlední řadě je projekt provázán s navazujícími granty. UNCE 204021

Výsledky a jejich prezentace Semináře 2x ročně (další bude 26.11. ve 12h) Prezentace výsledků - veřejná Webové stránky http://unce1.lf1.cuni.cz/ slouží jako informační centrum a vytvářejí historii grantovému projektu Bude vytvořena tvář WEBu, jež bude upozorňovat na novinky – především prestižní publikace. UNCE 204021

Cíl 1 Stopka et al. UNCE 204021

Specifický cíl 1a Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů.   Cíl 2b. Studium molekulárních mechanizmů buněčné transdiferenciace. Senior: T Stopka (1 a 2) Junioři: P Burda (2), V Pospíšil (2), N Čuřík (1), K Vargová (1) Další participace: P Vlčková (1), M Kapalová (1), T Zikmund (1) Cíl 1. Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů.   Cíl 2. Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Cíl 3. Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukemií a lymfomů a jejich následná fenotypová charakterizace ve vztahu k pochopení mechanizmů vybraných tumor-specifických terapeutik. Cíl 4. Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování defektů rozličných tkání. UNCE 204021

Obecné principy Experimentální hematologie: modelování funkce rozličných molekul, jež se účastní diferenciace kmenové buňky. Myší transgenika: gene knockout (delece) a knock in (vnesení) v ES buňkách mechanizmem homologní rekombinace. … jež jsou součástí řešeného cíle. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021

Molekulární úroveň Transkripční faktory: PU.1 – hlavní regulátor diferenciace kmenové krvetvorné buňky, „leukemia suppressor“. Chromatin remodelační faktory: Smarca5, skládá a rozkládá nukleozóm, účastní se dějů na DNA. Postranskripční regulace: mikroRNA (inhibitory exprese). Molekuly, jež se účastní vybraných mechanismů, jež jsou řešeny. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021

Medicínská úroveň Hematologické malignity: AML, CML, MDS, CLL – role vybraných molekul v downregulaci PU.1 (prognostický význam) Epigenetická terapie (5-AZA u MDS): ovlivňuje krvetvorbu mechanizmem odblokování exprese některých tumor supresorových genů (např. PU.1). Bude ukázáno, jaké má řešení cíle význam pro lékařství – diagnostka, terapie, prognostika, patogeneze atd. Souvislost může být i vágní, např. studium buněčné proliferace a nádorová biologie. Nicméně se předpokládá, že medicínská úroveň projektu bude určitým lákadlem pro hodnotitele průběžných zpráv. UNCE 204021

Metodika Experimentální modely: transgenní myši, derivované buněčné linie, genetická manipulace v buněčné linii. Molekulární metodiky: vnesení nukleových kyselin do buňky, celogenomová analýza fenotypu, zobrazovací metodiky v myši, RNA FISH. Předpokládá se, že bude uveden počet myší či jiných experimentálních zvířat v experimentu v daném roce. Vzhledem k dost významným platbám do Centra biomodelů je upřesnění těchto požadavků vhodné. Molekulární metodiky mají odhalit, jak složité eseje jsou plánovány. Předpokládá se, že náročnost molekulárních metodik se bude v průběhu řešení projektu zvyšovat. UNCE 204021

Role PU.1 u malignit krvetvorby PhD studium od r. 2006, juniorem od 6/2012 1) jaká je role 5-AZA v regulaci exprese genu PU.1 (Čuřík et al. 2011, Leukemia, IF:8,99). Chromatinová struktura genu PU.1 reaguje specificky na 5-AZA. Je možné využít testování odpovědi na 5-AZA in vitro na úrovni chromatinu (srovnání s OS pacientů). 2) je gen pro PU.1 mutován u MDS? (deep sequencing). Ovlivňuje hladina PU.1 agresivitu MDS a AML (myší model – Vlčková et al 2012) N. Čuřík PhD studium od r. 2006 (juniorkou během 2. ½ 2012) Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. K. Vargová UNCE 204021

Role Smarca5 v krvetvorbě 3) nepostradatelná role Smarca5 v krvetvorbě? Kondiciální delece v myši ukazuje na specifický defekt krvetvorby. (Kokavec et al. v přípravě) 4) testování role Smarca5 jako onkogenu – kondiciální aktivace transgenu (knock in) – aktuálně na úrovni rekombinace ES buněk (T. Zikmund). Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021

Transdiferenciace krvetvorných buněk PhD 2005-2011, Opletalova cena 1.LFUK za rok 2011 5) role rozličných hladin PU.1 v inhibici onkogenních mikroRNA (miR-17-92) a v produkci odlišných krevních elementů. Genetický program PU.1 – cílové geny a jejich schopnost „senzovat“ odlišné hladiny TF. 6) role antagonizmu PU.1 a GATA-1 v regulaci liniové determinace. Jak 2 vzájemně se blokující transkripční faktory regulují produkci odlišných krevních elementů? V. Pospíšil PhD 2006-2011, řešitel GAUK a od r. 2012 GAČR postdoc Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. P. Burda UNCE 204021

Nejvýznamnější výstup 5-azacitidine in aggressive myelodysplastic syndromes regulates chromatin structure at PU.1 gene and cell differentiation capacity. Curik N, Burda P, Vargova K, Pospisil V, Belickova M, Vlckova P, Savvulidi F, Necas E, Hajkova H, Haskovec C, Cermak J, Krivjanska M, Trneny M, Laslo P, Jonasova A, Stopka T. Leukemia. 2012 Feb 20. IF: 8,99 Teze publikace: a) 5-AZA ovlivňuje chromatinovou strukturu a expresi genu PU.1 b) 5-AZA vlivem na PU.1 zapíná krvetvornou diferenciaci c) míra represe PU.1 u MDS koreluje s přežíváním na 5-AZA – plánuje se klinické testování (AZA/G-CSF) Uvede se název, autoři a cílový časopis pro první submitování. Budou uvedeny tři základní zjištění z této publikace. Na publikaci je nutné mít dedikaci projektu: UNCE 204021. UNCE 204021

Výstupy projektu Pořádané odborné akce: Další publikace (jen citace s uvedením IF) Pořádané odborné akce: Genes, Genetics & Genomics (G3) 2012. International Symposium on Gene Regulation in Normal and Pathologic States. http://g3.lf1.cuni.cz/ Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF (1) a souhrnný IF (8,99). Kdo konkrétně a z jakých zdrojů bude prezentovat výzkumnou práci na konferenci. UNCE 204021

Plánované aktivity Experimenty: Smarca5 - kondiciální delece v T buňkách (T Zikmund), Ctcf – interakce se Smarca5 (M. Kapalová), Smarca5 – kondiciální transgen v myši (T Zikmund) Publikace: Vlčková et al. (role inhibice PU.1 v agresivitě AML) těsně před odesláním Kokavec et al. před odesláním, zdržení při dokončování na straně kolaborátora (vliv kondiciální inaktivace Smarca5 v krvetvorbě) Zde se uvede výhled na další období: co bude řešeno a zdůvodnění. P. Vlčková UNCE 204021

Cíl 2 Nečas et al. UNCE 204021

Senior: Emanuel Nečas Junioři: Jana Michalová Katarina Forgáčová Specifický cíl 2.  Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Senior: Emanuel Nečas Junioři: Jana Michalová Katarina Forgáčová Cíl 1. Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů.   Cíl 2. Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Cíl 3. Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukemií a lymfomů a jejich následná fenotypová charakterizace ve vztahu k pochopení mechanizmů vybraných tumor-specifických terapeutik. Cíl 4. Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování defektů rozličných tkání. UNCE 204021

Základní uvedení do problematiky specifického cíle kmenová krvetvorná buňka progenitorová krvetvorná buňka niche spolu tvoří základní funkční jednotku krvetvorby … jež jsou součástí řešeného cíle. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021

Základní uvedení do problematiky specifického cíle (molekulární úroveň) Molekulární úroveň interakcí v základní funkční jednotce je studována z metodických důvodů většinou nepřímo: 1. narušením rovnovážného stavu např. ozářením, cytostatiky 2. genovou manipulací (knock-out, knock-in) Molekuly, jež se účastní vybraných mechanismů, jež jsou řešeny. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021

Základní uvedení do problematiky specifického cíle (medicínská úroveň) transplantace kostní dřeně nádorová hematopoeza kmenové buňky v regenerační medicíně všeobecně Bude ukázáno, jaké má řešení cíle význam pro lékařství – diagnostka, terapie, prognostika, patogeneze atd. Souvislost může být i vágní, např. studium buněčné proliferace a nádorová biologie. Nicméně se předpokládá, že medicínská úroveň projektu bude určitým lákadlem pro hodnotitele průběžných zpráv. UNCE 204021

Konkrétní vědecké otázky 1) podstata změněné zdatnosti (fitness) kmenových buněk myší UBC-GFP 2) podstata snížené fitness kmenových buněk z regenerované krvetvorné tkáně Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021

Konkrétní vědecké otázky 3) obsazování a uzavírání nichí kmenovými a progenitorovými buňkami Terp53-/- 4) latentní přítomnost dárcovských kmenových a progenitorových buněk transplantovaných neozářenému příjemci Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021

Konkrétní vědecké otázky 5) 6) Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021

Metodika (experimentální modely) transplantace krvetvorné tkáně normálním, submyeloablativně a myeloablativně ozářeným příjemcům, sledování úrovně chimerismu (A/B ev. C a D) Předpokládá se, že bude uveden počet myší či jiných experimentálních zvířat v experimentu v daném roce. Vzhledem k dost významným platbám do Centra biomodelů je upřesnění těchto požadavků vhodné. Molekulární metodiky mají odhalit, jak složité eseje jsou plánovány. Předpokládá se, že náročnost molekulárních metodik se bude v průběhu řešení projektu zvyšovat. UNCE 204021

Metodika (molekulární metody) mRNA a miRNA profiling PCR specifických kandidátních mRNA (adhezivní molekuly) v separovaných buňkách LSK (asi 50 tisíc/femur x asi 1000 buněk kmenových) - ve stromatu krvetvorné tkáně (zbavené krvetvorby ozářením) Předpokládá se, že bude uveden počet myší či jiných experimentálních zvířat v experimentu v daném roce. Vzhledem k dost významným platbám do Centra biomodelů je upřesnění těchto požadavků vhodné. Molekulární metodiky mají odhalit, jak složité eseje jsou plánovány. Předpokládá se, že náročnost molekulárních metodik se bude v průběhu řešení projektu zvyšovat. UNCE 204021

Nejvýznamnější výstup Minimálně 1 publikace v přípravě (před odesláním) či již vyšlá do 6 měsíců. Forgáčová et al: Timing of transplantation window... (BBMT) Forgáčová/Nečas: review (Folia Biol) Teze publikace: a) b) c) Uvede se název, autoři a cílový časopis pro první submitování. Budou uvedeny tři základní zjištění z této publikace. Na publikaci je nutné mít dedikaci projektu: UNCE 204021. UNCE 204021

Výstupy projektu Další publikace (jen citace s uvedením IF) Abstrakta a další výstupy. Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF a souhrnný IF. Kdo konkrétně a z jakých zdrojů bude prezentovat výzkumnou práci na konferenci. UNCE 204021

Plánované aktivity (experimenty) je dokončována analýza „transplantačního okna“ u letálně ozářených myší pokračuje analýza myší UBC-GFP ◊ zpracování a interpretace mRNA profilu v kadaverózní krvetvorné tkáni postrádající ATP (Illumina) Zde se uvede výhled na další období: co bude řešeno a zdůvodnění. UNCE 204021

Problémy, potřeba spolupráce ... Illumina ... V kadaverózí „umírající“ tkáni kosní dřeně se postupně snižuje zastoupení desítek, stovek, a tisíců specifických mRNA ... Současně se ZVYŠUJE zastoupení skoro stejného počtu jiných mRNA ... ????? Zde se uvede výhled na další období: co bude řešeno a zdůvodnění. UNCE 204021

Cíl 3 Klener et al. UNCE 204021

Specifický cíl č.3: Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukémií a lymfomů Cíl 1. Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů.   Cíl 2. Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Cíl 3. Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukemií a lymfomů a jejich následná fenotypová charakterizace ve vztahu k pochopení mechanizmů vybraných tumor-specifických terapeutik. Cíl 4. Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování defektů rozličných tkání. Senior: doc. Jan Živný, Ph.D. Junioři: MUDr. Pavel Klener, Ph.D., MUDr. Jan Molinský, MUDr. Magdalena Klánová, MUDr. Bokang Maswabi UNCE 204021 UNCE 204021 31

Základní uvedení do problematiky specifického cíle Obecné principy -imunodeficientní myši umožňují engraftment buněčných linií lidských leukémií a lymfomů v myším organismu -růst xenotransplantátu v myším organismu umožňuje preklinické studium role mikroprostředí, šíření tumoru, novotvorby cév či experimentální in vivo terapii … jež jsou součástí řešeného cíle. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021 UNCE 204021 32

Základní uvedení do problematiky specifického cíle Molekulární úroveň Bude studována změna genové exprese a fenotypu buněk rostoucích in vivo v porovnání s in vitro rostoucími liniemi Bude studován vliv cílené změny exprese vybraných genů (např. adhezivních molekul) na engraftment, růst, šíření a neovaskularizaci xenotransplantovaných tumorů. Molekuly, jež se účastní vybraných mechanismů, jež jsou řešeny. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021 UNCE 204021 33

Základní uvedení do problematiky specifického cíle Medicínská úroveň -myší model lidské leukémie a lymfomu nám umožní studium patogeneze lidských malignit na preklinickém modelu -myší model bude sloužit pro preklinické zhodnocení účinnosti vybraných protinádorových látek Bude ukázáno, jaké má řešení cíle význam pro lékařství – diagnostka, terapie, prognostika, patogeneze atd. Souvislost může být i vágní, např. studium buněčné proliferace a nádorová biologie. Nicméně se předpokládá, že medicínská úroveň projektu bude určitým lákadlem pro hodnotitele průběžných zpráv. UNCE 204021 UNCE 204021 34

Konrétní vědecké otázky 1) charakterizace engraftmentu a šíření buněk linií lymfomu z plášťových buněk (MCL) v jednotlivých myších orgánech pomocí imunohistochemie a průtokové cytometrie 2) studium genové exprese a fenotypu buněk MCL buněk získaných ex vivo z myších orgánů ve srovnání s in vitro rostoucími MCL liniemi. Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021 UNCE 204021 35

Konrétní vědecké otázky 3) role exprese adhezivních molekul CD31/PECAM a CD44/Hermes v engraftmentu, růstu, šíření a neovaskularizaci MCL tumorů 4) role exprese VEGF receptorů (VEGFR1, 2, 3) v engraftmentu, růstu, šíření a neovaskularizaci MCL tumorů Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021 UNCE 204021 36

Konrétní vědecké otázky 5) studium molekulárních mechanismů regulujících neovaskularizaci podkožních MCL tumorů 6) experimentální terapie MCL pomocí anti-angiogenních léčiv Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021 UNCE 204021 37

Metodika Experimentální modely: Počítá se se stabilní kohortou cca 80-120 myšek v pokuse + cca 60-80 myšek v chovném jádře Molekulární metodiky: příprava transgenních linií se stabilně zvýšenou či sníženou expresí vybraných genů studium změn genové exprese pomocí real-time RT-PCR a mikročipů studium proteinové exprese pomocí western blottingu a průtokové cytometrie izolace buněčných subpopulací pomocí magnetických kolon Předpokládá se, že bude uveden počet myší či jiných experimentálních zvířat v experimentu v daném roce. Vzhledem k dost významným platbám do Centra biomodelů je upřesnění těchto požadavků vhodné. Molekulární metodiky mají odhalit, jak složité eseje jsou plánovány. Předpokládá se, že náročnost molekulárních metodik se bude v průběhu řešení projektu zvyšovat. UNCE 204021 UNCE 204021 38

Nejvýznamnější výstup Minimálně 1 publikace v přípravě (před odesláním) či již vyšlá do 6 měsíců: Mouse model of human mantle cell lymphoma (MCL) for the study of MCL biology and for preclinical assessment of experimental treatment approaches. Teze publikace: a) Myší model MCL je biologicky podobný agresivní blastoidní variantě MCL u člověka b) MCL buňky rostoucí v myši mají odlišný fenotyp v porovnání s MCL buňkami rostoucími in vitro c) Experimentální terapie blastoidního MCL: cisplatina vykazuje významný protilymfomový efekt v terapii blastoidního MCL Uvede se název, autoři a cílový časopis pro první submitování. Budou uvedeny tři základní zjištění z této publikace. Na publikaci je nutné mít dedikaci projektu: UNCE 204021. UNCE 204021 UNCE 204021 39

Výstupy projektu Další publikace (jen citace s uvedením IF) Zatím ne Abstrakta a další výstupy. Celkový výsledek cíle: celkový počet prací s IF a souhrnný IF. Kdo konkrétně a z jakých zdrojů bude prezentovat výzkumnou práci na konferenci. UNCE 204021 UNCE 204021 40

Plánované aktivity Experimenty: 1. Charakterizace myšího modelu MCL za použití xenotransplantace primárních buněk izolovaných od pacientů s blastoidním MCL. Primární buňky, které nerostou in vitro, lze „propagovat“ pomocí sériových transplantací v imunodeficientních myších  vliv mikroprostředí myšího organismu= experimentální model blíže biologii MCL u člověka. 2. Charakterizace dvou nových linií MCL odvozených od 2 pacientů s MCL: UPF1E, UPF2A. Včetně xenotransplantací do imunodeficientních myší. Publikace: zatím ne. Zde se uvede výhled na další období: co bude řešeno a zdůvodnění. UNCE 204021 UNCE 204021 41

Cíl 4 Šedý et al. UNCE 204021

Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování rozličných tkání unce204021 Senior: Doc. René Foltán Junioři: Dr. Jiří Šedý Dr. Jiřina Nieblerová Dr. Erika Kužmová Cíl 1. Studium role genové transkripce a remodelace chromatinové struktury v diferenciaci kmenových buněk a příprava dalších myších transgenních modelů.   Cíl 2. Studium molekulárních mechanizmů transplantace krvetvorných kmenových buněk a mechanizmů buněčné transdiferenciace. Cíl 3. Vývoj a studium myších modelů xenotransplantace lidských nádorových buněk leukemií a lymfomů a jejich následná fenotypová charakterizace ve vztahu k pochopení mechanizmů vybraných tumor-specifických terapeutik. Cíl 4. Studium kmenových buněk ve vztahu k doplňování defektů rozličných tkání. UNCE 204021 UNCE 204021 43

Základní uvedení do problematiky specifického cíle Cílem projektu je posoudit možnosti implantace kmenových buněk a osteoindukčních biomateriálů do kostěných defektů na modelu laboratorního potkana. … jež jsou součástí řešeného cíle. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021 UNCE 204021 44

Základní uvedení do problematiky specifického cíle MSCs reprezentují v současné době roli hlavního kandidáta v regenerativní medicíně, včetně augmentace kosti, pomocí přímých i nepřímých mechanismů, kterými potencují regeneraci kosti. Lepší pochopení těchto mechanismů umožní zdokonalit techniky lokální terapie kostních defektů, optimalizaci jejich využití, indikací a napomůže maximální využití jejich společných účinků s biomateriály Bude ukázáno, jaké má řešení cíle význam pro lékařství – diagnostka, terapie, prognostika, patogeneze atd. Souvislost může být i vágní, např. studium buněčné proliferace a nádorová biologie. Nicméně se předpokládá, že medicínská úroveň projektu bude určitým lákadlem pro hodnotitele průběžných zpráv. UNCE 204021 UNCE 204021 45

Základní uvedení do problematiky specifického cíle MSCs mají obrovský terapeutický potenciál, který je zatím jen velmi málo využitý. Neexistují žádné spolehlivé selektivní markery pro MSCs. I proto jsou vlastnosti MSCs stále neprobádané. Jedna z teorií o MSCs předpokládá „MSCs niche“ centralizovanou v jednom orgánu/tkáni, odkud jsou MSCs mobilizované a migrují k místu léze, ale zabezpečují i neustálou fyziologickou obnovu tkání. Molekuly, jež se účastní vybraných mechanismů, jež jsou řešeny. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021 UNCE 204021 UNCE 204021 46 46

Základní uvedení do problematiky specifického cíle Incidence MSCs v tkáních není dostatečná a pro terapeutické cíle je nutná jejich expanze ex vivo. MSCs izolované z různých tkání sa mírně od sebe liší nejen fenotypově, ale i terapeutickým potenciálem. Podmínky in vitro kultivace zásadně ovlivňují přežívání, proliferaci, diferenciaci a jiné vlastnosti MSCs in vivo. Stále přibývající práce o 3-D kultivaci MSCs in vitro ukazují, že 2-D kultury velmi zkreslují přirozené projevy MSCs (produkce jiných signálních molekul, exprese jiných povrchových markerů, ...). … jež jsou součástí řešeného cíle. Budou uvedeny jen ty, jež mají souvislost s vědeckými otázkami (viz dále) UNCE 204021 UNCE 204021 UNCE 204021 47 47

Konkrétní vědecké otázky 1) Jak nejlépe MSCs kultivovat 2) Jak nejlépe MSCs a biomateriály aplikovat na místo určení Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021 UNCE 204021 48

Konkrétní vědecké otázky 3) Jaká doba je nutná k reparaci kostěného defektu 4) Jaká je kvalita reparované kosti Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021 UNCE 204021 49

Konkrétní vědecké otázky 5) Jaký je osud MSCs v lézi Vědecké otázky mají konkrétně specifikovat, jaké vědecké cíle jsou kladeny. Měly by být srozumitelné, bez užití velkého množství zkratek či méně známých pojmů. Otázky by měly být unikátní, současné. Předpokládá se, že jejich zodpovězení je součástí navrhovaných cílů. Předpokládá se, že každý specifický cíl bude mít cca 6 vědeckých otázek, jež budou řešeny výzkumnými „podtýmy“. Na diskusi se budou podílet nejen senioři, ale i konkrétní vědečtí pracovníci, pokud to bude nutné. UNCE 204021 UNCE 204021 50

Metodika a předběžné výsledky A Bone defect only B Bone defect with HA C B+hMSC (0,5mil.) D B+hMSC (5mil.) E B+rMSC (0,5mil.) F B+rMSC (5mil.) A B C D rMSC 8 weeks P0 P1 P2 1.5x5x1.5mm E hMSC CEM-OSTETIC HA scaffolds CD105+, CD73+, CD90+ and CD45-, CD34-, CD14- or CD11b-, CD79 α-, HLA-DR- UNCE 204021 UNCE 204021 C 51 D

Results-histomorphomerical analysis * Error bars show SEM. UNCE 204021 UNCE 204021

Results Representative Micro CT scan of vertebral deffect (Group 3) Representetive Micro CT scan of vertebral deffect (Group 4) UNCE 204021 UNCE 204021

Nejvýznamnější výstup Bone scaffold combined with mesenchymal stem cells in the treatment of vertebral body defects. Vaněček V, Klíma K, Kohout A, Foltán R, Jiroušek O, Šedý J, Štulík J, Syková E. V přípravě. Teze publikace: a) hMSCs v kombinaci s CEM-Ostetic jsou bezpečnou modalitou v reparaci kosti b) hMSCs v kombinaci s CEM-Ostetic mají vysoký reparativní potenciál v kosti c) optimální je velké množství buněk (5 milionů) Uvede se název, autoři a cílový časopis pro první submitování. Budou uvedeny tři základní zjištění z této publikace. Na publikaci je nutné mít dedikaci projektu: UNCE 204021. UNCE 204021 UNCE 204021 54

Výstupy 1 původní práce (+2 v přípravě) 1 monografie 6 kapitol v monografii 1 habilitační práce 2 publikace menšího rozsahu 2 pořádané odborné akce Uvede se název, autoři a cílový časopis pro první submitování. Budou uvedeny tři základní zjištění z této publikace. Na publikaci je nutné mít dedikaci projektu: UNCE 204021. UNCE 204021 UNCE 204021 55

Plánované aktivity Experimenty: 1. Detailní studium osudu MSCs v lézi organismu 2. Převedení terapeutického protokolu do autologního režimu Publikace: zejména další primární publikace Zde se uvede výhled na další období: co bude řešeno a zdůvodnění. UNCE 204021 UNCE 204021 56