F.I.S.H. hotovo

Příprava sond pro komparativní genomovou hybridizaci z malého množství materiálu Romana Zaoralová školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. pracoviště: Integrovaná laboratoř molekulární cytogenetiky, PřF MU a PDM FN Brno hotovo

Příprava sond pro CGH z malého množství materiálu úvod - CGH cíle metody WGA značení sond materiál výsledky hotovo

CGH komparativní genomová hybridizace, 1992 http://www.lucia-cytogenetics.com komparativní genomová hybridizace, 1992 detekce kvantitativních změn genetického materiálu citlivost: 5-10 Mb (metafáze) vyžadovaná velikost sondy: nad 300 bp nutné 2-3 g DNA (500 000 buněk, 1 b.  6,6 pg) hotovo

Cíle práce Amplifikace pikogramových množství DNA Následné fluorescenční značení Komparativní genomová hybridizace Hotovo

Metody Whole genome amplification – amplifikace veškeré DNA ve vzorku DOP-PCR LA-PCR IRS-PCR Doladit časování PEP SDA - GenomiPhi Alu-PCR i-PEP Tagged-PCR

DOP-PCR SDA - GenomiPhi degenerate oligonucleotide primed PCR, 1992 5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3' rozdělení cyklů: preamplifikační krok SDA - GenomiPhi Bacha – čtvereček. DOPka a GenomiPhi strand displacement amplification izotermní amplifikace polymeráza fága 29 http://www.amershambiosciences.com

Nick-translace inkorporace značených nukleotidů do DNA kombinace dvou enzymů: DNáza + DNA polymeráza s 5‘-3‘ exonukleázovou aktivitou dochází ke štěpení DNA Nick-translace

Ulysis - ULS® - universal linkage system http://www.invitrogen.com Ulysis - ULS® - universal linkage system - sloučenina Pt konjugovaná s  fluorochromem, reagující s N7 guaninu - rychlá metoda (značení 15 minut) - vhodná pro značení krátkých fragmentů DNA – neštěpí řetězec Ulysis a značený nukleotidy

Materiál Testování: normální DNA naředěná na definovanou koncentraci Aplikace: archivní materiál – onkologické vzorky: solidní nádory mikrodisekce hotovo

Výsledky – WGA DOP-PCR, Taq polymeráza SDA/GenomiPhi hotovo DOP-PCR, „long“ polymerázy DOP-PCR, „long“ polymerázy

Výsledky – značení sond Značení přidáním nukleotidů do PCR Nick translace Nick translace Animačky, hotovo ULS

Další postup „long“ polymerázy + nick translace: aplikace na známé vzorky, popis rozsahu citlivosti a použitelnosti v závislosti na typu aberací a počtu dostupných buněk   Výhledově: HR-CGH, kvantitativní popis amplifikace hotovo

F.I.S.H. hotovo