DNA Hybridizační techniky
Obsah Princip metody Rozdělení metod Technika měření reasociační kinetiky Využití metody Výhody a úskalí
Princip metody DNA lze snadno denaturavat na jednotlivé komplementární řetězce Za vhodných podmínek komplementární řetězce reasociují na dvouřetězec Míra v jaké a rychlost s jakou dva jednořetězce reasociují závisí na stupni jejich podobnosti
Základní uspořádání Reasociace s DNA na pevném nosiči Dot blot Slot blot Southern blot Reasociace ve vodném roztoku
Měření reasociace v roztoku Izolovat (purifikovat) DNA Nalámat na vhodnou délku (500 pb) Změřit přesně její koncentraci Denaturovat teplem Smísit DNA dvou porovnávaných druhů Postupně ochladit Změřit procento renaturované DNA Vypočíst podobnost sekvencí Vypočíst počty mutací od okamžiku odvětvení
Kvantifikace reasociace Stanovit střední teplotu tání homoduplexů Tm= (TmA + TmB)/2 Stanovit teplotu tání heteroduplexu Vypočítat pokles ΔTm ∆Tm=((TmA + TmB)/2) - Tms Vypočítat p p = ΔTm . 0,01 (0,015) K = -3/4 ln(1 - 4/3 p)
Technické triky Tracer a driver Odstranění repetitivních sekvencí Způsoby monitorování míry reasociace Extinkce jednořetězcové a dvouřetězcové DNA Chromatografické oddělení na hydroxyapatitu Rozštěpení ssDNA pomocí S1 nukleázy
A B fragmentace denaturace radioaktivní značení renaturace S1 štěpení detekce
Výhody metody Multilokusová (totilokusová) metoda Použitelná na nejvzdálenější taxony
Nevýhody metody Distanční metoda Experimentálně dosti náročná Práce s izotopem Vyžaduje speciální vybavení Vyžaduje větší množství DNA (mg) Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA) Experimentální náročnost N x N
Závěry Na velmi vzdálené taxony výhodné Měla by provádět specializovaná laboratoř Většinou lze nahradit jinými metodami (MLST) V budoucnu možná taxonomické DNA čipy