Sekvenování
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Znaková dat sekvence čtyř nukleotidů v RNA či DNA sekvence 20 aminokyselin v proteinu možnost převodu DNA na protein možnost převodu znakových dat na data distanční
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Výchozí materiál dostatečně krátké homogenní úseky NA rRNA, plasmidy, viry, organelová DNA zaklonování krátkých úseků DNA PCR amplifikace vhodného úseku
cyklus 1 cyklus 3 cyklus 2 40°C, 72°C 94°C 40°C 72°C 94°C, 40°C, 72°C
Sekvenování dlouhých úseků shot gun strategie (strategie hrubé síly) DNA walking strategie navrhování PCR primerů „Primer select“
Sekvenování dlouhých úseků shot gun strategie (strategie hrubé síly) DNA walking strategie navrhování PCR primerů „Primer select“ přímá sekvenace x zaklonování fragmentů
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Techniky Maxam-Gilbert (chemická) Sanger – (dideoxyribonukleotidová) Microarrays
Maxam-Gilbert metoda 5’-GATCAGGCTTAAGCA-3’ 3’-CTAGTCCGAATTCGT-5’ denaturace, radioaktivní značení *P-GATCAGGCTTAAGCA dimethylsulfát piperidin kyselina mravenčí piperidin hydrazin piperidin hydrazin NaCl piperidin štípe před G štípe před A a G štípe před T a C štípe před T *P-GATCA *P-G *P-GA *P-GAT *P-GATCAG *P-GATC *P-GAT *P-GATCAGG *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCA *P-GATCAGG *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCAG *P-GATCAGGC *P-GATCAGGCTT *P-GATCAGGCT *P-GATCAGGCTTA *P-GATCAGGCTTAAG *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCAGGCTAAGC
Maxam-Gilbert metoda II A+G T+C G C A + + + _ _ _ C G A A T T C G G A CT A
Sanger metoda příprava jednořetězcového templátu (denaturace) 5’-GTTTTCCCAGTCACGACAATCAGGCTTAAA-3’ 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ příprava jednořetězcového templátu (denaturace) 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ reasociace s primerem 5’-GTTTCCCAGTCACGAC-3’ 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ syntéza řetězce (jeden nukleotid radioaktivní) ddATP ddCTP ddGTP ddTTP primer-A primer-AATC primer-AATCAG primer-AAT primer-AA primer-AATCAGGC primer-AATCAGG primer-AATCAGGCT primer-AATCA primer-AATCAGGCTT primer-AATCAGGCTTA primer-AATCAGGCTTAA primer-AATCAGGCTTAAA
Sanger metoda II + + + _ _ _
T G 94°C T G A G T 40°C G A A G 72°C C G T G G A G G A T C G T
Automatická sekvenace – značené dideoxyribonukleotidy čtyři dideoxyribonukleotidy značené fluorescenčními značkami
Automatická sekvenace – značené primery primery značené fluorescenční značkou
Automatická sekvenace – PCR cyklická sekvenace dideoxyribonukleotidy značené fluorescenční značkou
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Příčiny nejednoznačných výsledků přímá sekvenace: současná sekvenace několika úseků (repetitivní sekvence, cizorodá DNA, heteroplázie) řešení: zaklonovat zaklonovaná DNA: PCR chyby řešení: sekvenovat několik klonů
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Manipulace s daty převedení do vhodného formátu „Chromas“ formát .SCF, „BioEdit“ spojování kontigu „Seqman“ (součást DNASTAR) kontrola kvality sekvence
Manipulace s daty převedení do vhodného formátu „Chromas“ formát .SCF, „BioEdit“ spojování kontigu „Seqman“ (součást DNASTAR) kontrola kvality sekvence ruční začisťování sekvence „BioEdit“
Explorační analýza získané sekvence Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice
Explorační analýza získané sekvence Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice vyhledávání homologických sekvencí v databázi Genbenk (NCBI), EMBL, PIR „Blast“
Explorační analýza získané sekvence Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice vyhledávání homologických sekvencí v databázi Genbenk (NCBI), EMBL, PIR „Blast“ v případě kódující sekvence překlad a kontrola produktu (BioEdit)
Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky
Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR
Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR alignment „Clustal X“, „Megalign“
Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR alignment „Clustal X“, „Megalign“ ruční dočištění alignovaných sekvencí „BioEdit“
Shrnutí Sekvenování je možno považovat za rutinní techniku molekulární fylogenetiky Klíčem k úspěchu je kvalitní výchozí DNA (čistota, délka, homogenita) Výběr vhodné techniky vyplývá z vybavení pracoviště a finančních možností Pozor na chyby a artefakty Osekvenováním práce nekončí, data nutno převést na znaky