KVANTITATIVNÍ TERMODYNAMIKA 4.ročník biochemie

Bioenergetika v kostce ... BENG-qTD Bioenergetika v kostce ...

BENG-qTD Něco na úvod... Učebnice biochemie jsou plné omylů, chyb a nesprávných vysvětlení, vyplývajících z „termodynamické ignorance“ Báje a mýty: * „ATP jako vysokoenergetická sloučenina“ * pojem „makroergní sloučeniny“ * „účinnost přeměny energie 40%“

Trochu opakování … Systémy: Izolované (adiabatické) Uzavřené BENG-qTD Trochu opakování … Systémy: Izolované (adiabatické) Uzavřené Otevřené – vyžadují popis pomocí nerovnovážné TD Příspěvek rovnovážné TD v biochemii: Studium jednotlivých reakcí jako uzavřené systémy Otázka rovnovážného stavu reakce Odchylka aktuálního stavu z rovnováhy Hlavní nástroj pro: Výpočet rovnovážných podmínek při přenosu energie a určení odchylky od rovnovážného stavu (= schopnost vykonávat práci) Eliminace „termodynamicky nemožných“ reakcí

Entropie a Gibbsova energie BENG-qTD Někdo na entropii nevěří …

Entropie a Gibbsova energie 2 BENG-qTD Entropie – hnací síla Enthalpie (teplo) Gibssova energie = zahrnuje výměnu tepla a tok entropie G = H - TS Gibbs-Helmholtzova rovnice Pokud G < 0 systém je schopen vykonávat práci (pokud je k dispozici příslušný mechanismus, kterým ji může vykonávat) Gibbsova energie v biochemii: 1) Reakce substrátů „zásobujících“ respirační řetězec a syntézu ATP 2) Redoxní potenciály při přenosu elektronů (dýchání, fotosyntéza) 3) Elektrochemické gradienty při přenosu iontů na membránách 4) Energie při absorbci kvant světla při fotosyntéze

G jako funkce odchylky z rovnováhy BENG-qTD Gibbsova energie = funkce poměru mezi pozorovaným a rovnovážným stavem reaktantů a produktů  G odpovídá Gibbsově energii/mol uvolněné při průběhu reakce beze změny koncentrace substrátu a produktu (in vivo)

G a rovnovážná konstanta reakce BENG-qTD VÝCHODISKO: - uvažování reakcí ve smyslu vychýlení z rovnovážného stavu Lze odvodit: G = -2.3 RT log K/  R … plynová konstanta T … absolutní teplota  … poměr nerovnovážných konc. Z toho vyplývá: G je funkcí vychýlení z rovnováhy G je negativní pro  < K G je pozitivní pro  > K Cc obsDd obs  = Aa obsBb obs ZÁVĚR: - G nedává odpověď na otázku: „Kolik energie se uvolní při průběhu reakce z aktuálního stavu do rovnováhy ?“

Hodnoty G pro hydrolýzu ATP BENG-qTD K ´= [ADP] [Pi] [ATP] zdánlivá reakční konstanta pro hydrolýzu ATP na ADP a Pi Za „fyziologického“ stavu (pH= 7, 10-2 Mg2+ ) lze určit: K ´= 105 M ( ignorujeme vliv vody, pH, ionizačního stavu,…) a) Pro rovnovážný stav platí platí:  ´= K ´= 105 M pro cytoplazmu (10-2 Pi, 10-3 ADP) – odhad rovnovážné koncentrace ATP 10-10 b) MTCH udržují odchylku od rovnovážného stavu na ´= 10-5 M pro MTCH (10-2 Pi, 10-5 ADP) - odhad koncentrace ATP 10-2 „Fosforylační potenciál“ G (pro syntézu) = - G (pro hydrolýzu)

Hodnoty G pro hydrolýzu ATP BENG-qTD

Zdánlivé TD konstanty K´ … zdánlivá rovnovážná konstanta BENG-qTD K´ … zdánlivá rovnovážná konstanta Vztah k reálným podmínkám v buňce: aktivita vs. koncentrace H2O jako reaktant nebo produkt Ionizační stavy a chelatace Ad 1) * v biochemických systémech nelze určit aktivity všech reaktantů = používaní koncentrací Ad 2) * v ředěných roztocích = voda jakoby ve standardním stavu (tj. jako čistá kapalina při tlaku 1 atm) tj. neobjevuje se v rovnicích (pokud jsou K a  definovány za stejných podmínek)

[ ATP] = [ATP4-] + [ATP3-] + [ATP.Mg2-] + [ATP.Mg- ] K´ a ionizační stav BENG-qTD Ad 3) * jeden nebo více reaktantů nebo produktů ionizovatelný * nebo je schopen chelatovat kation Rovnovážná konstanta – suma ionizovaných a chelatovaných forem nebo specifické formy vystupující v reakci ? [ ATP] = [ATP4-] + [ATP3-] + [ATP.Mg2-] + [ATP.Mg- ] Předpokládá se průběh reakce: ATP.Mg2- + H20 = ADP.Mg- + HPO42- + H+ Problémy: a) průběh reakce není zcela jasně znám b) experimentálně obtížné určit koncentrace forem „pravá konstanta“ K = [ADP.Mg-] [HPO42-] [H+] [ATP.Mg2-]

Omezená platnost K´ Závěr: K´není univerzální konstantou BENG-qTD Závěr: K´není univerzální konstantou K´je závislá na pH, koncentraci kationtu, … G je odvozena z K´ , proto: 1) G je podobně jako K´platná pouze pro příslušné podmínky 2) G musí být vypočteno za stejných podmínek jako K´ Obecně platí: G = -2.3 RT log10 K/  Pro hypotetické standardní podmínky (1M koncentrace, čistá kapalina nebo čistý plyn při tlaku 1 atm): G0 = -2.3 RT log10 K

Co vlastně znamená G0 ? G0 nevypovídá nic o: BENG-qTD G0 nevypovídá nic o: a) o hodnotě G0 pro reakci v buňce b) o směru spontánního průběhu reakce v buňce nebo o hodnotě G uvolněné (spotřebované) při reakci Lze odvodit: G = -2.3 RT log10 K/  G = -2.3 RT log10 K + 2.3 RT log10  G = G0 + 2.3 RT log10  Pro rovnovážné podmínky: G = 0 a tedy  = K

„Vysokoenergetické“ vazby v ATP - mýtus nebo realita ? BENG-qTD Schopnost reaktantů „vykonávat užitečnou práci“ je dána vychýlením aktuálního poměru koncentrací z rovnovážného stavu nikoliv vlastností jednotlivých složek reakce Příklad 1: moře naplněné rovnovážnou směsí ATP, ADP a Pi …. nic se neděje! Příklad 2: glukosa-6-P v koncentraci 1010 větší než rovnovážné … schopen konat práci v buňce jako ATP

 přenos elektronů v transportních řetězcích BENG-qTD REDOXní potenciály Dýchání a fotosyntéza  přenos elektronů v transportních řetězcích

Redox potenciály: trocha pojmů BENG-qTD Oxidačně-redukční reakce: Redoxní páry Příklad: Fe 3+.cyt c + 1 e-  Fe2+.cyt c Poloreakce Příklad: Pyruvát + NADH + H+  Laktát + NAD+ Oxidace NADH  NAD+ + H+ + 2e- Redukce Pyruvát + 2 H+ + 2e-  Laktát Redoxní reakce je možno popsat pomocí TD pojmů a veličin Používají se elektrochemické veličiny x někdy zamlžuje TD podstatu jevů

Stanovení redox potenciálů BENG-qTD Redoxní poloreakce jsou vratné a lze je popsat rovnovážnou konstantou ! PROBLÉM: * elektrony neexistují volně v roztoku * analogie v elektrochemii – rovnováha kov/roztok soli ŘEŠENÍ: - popis soustavy 2 poločlánků spojených můstkem (kovová elektroda v rovnováze s 1M roztokem soli) „Standardní vodíková elektroda“ = nulový potenciál - H2 při 1 atm na platinové elektrodě - v roztoku o 1M koncentraci H+ při 250C 2H+ + 2 e-  H2 Potenciály kovových elektrod se odvozují ve vztahu k elektrodě vodíkové

Redoxní potenciály v biochemii BENG-qTD Standardní redoxní potenciál: - definován vůči vodíkové elektrodě - Ox/Red komponent v jednotkové aktivitě (nebo 1M) - pH=0

Standardní redox potenciál BENG-qTD Standardní redoxní potenciál Eo je určen za definovaných standardních podmínek vůči vodíkové elektrodě Obdobně jako pro Gibbsovu energii lze pro redoxní pár Ox + ne  Red odvodit vztah: E = E0 + 2,3 RT/nF log10 ([Ox] /[Red]) R …. plynová konstanta F … Faradayova konstanta

Eh,pH=x = Em,pH=x + 2,3 RT/nF log10 ([Ox] /[Red]) Redox potenciál a pH BENG-qTD V redoxních reakcích často vystupují protony: Ox + ne + mH +  Red E0 se stává negativnějším se zvyšujícím se pH: změna 2,3 RT/F(m /n) mV na jednotku pH tj. při m = n je změna - 60mV/pH V biochemii se definuje standardní redox potenciál při pH 7 E0´ ( označován také Em,7 = „mid-point potenciál“) E0´ pro redox pár H +/ 1/2 H2 je 7 x (-60)mV= - 420 mV Pro hodnotu aktuálního potenciálu: Eh,pH=x = Em,pH=x + 2,3 RT/nF log10 ([Ox] /[Red])

Tabulka redox potenciálů BENG-qTD

Příklad: glutathion Redoxní pár oxidovaný/ redukovaný glutathione: BENG-qTD Redoxní pár oxidovaný/ redukovaný glutathione: GSSG + 2e + 2H +  2 GSH - Jeden z nejdůležitějších faktorů pro udržení redoxní rovnováhy v cytoplazmě a matrix MTCH Nestejné množství reaktantů a produktů = závislost redox potenciálu na absolutní koncentraci Pro n=2 Eh,pH 7 = E0´ + 30 log10 ([GSSG] /[GSH]2) E0´ = -240 mV (pH 7, 25oC, 1M GSSG a 1M GSH) Pro udržení redoxního potenciálu na – 200mV je potřeba: a) při celkové konc. glutathionu 10mM: 1.2mM GSSG b) při celkové konc. glutathionu 1mM: 20M GSSG

Význam celkové koncentrace glutathionu BENG-qTD ~ kinetický limit enzymu glutathion-reduktasy ?

Vztah G a rozdílu redox potenciálů BENG-qTD Pro redoxní páry A a B: Eh = Eh(A) – Eh(B) - Lze odvodit G = - nF Eh Z podmínky pro rovnováhu G = 0 …. Eh = 0 Příklad: mitochondrie NADH/NAD+ Eh,7 = - 280mV O2/H2O Eh,7 = + 780mV Eh = 1,16 V … měřítko TD nerovnováhy mezi páry - při přenosu 2 molů elektronů v dýchacím řetězci: G = -2 x 96,5 x 1,16 = - 224 kJ mol-1

Redoxní potenciály na membráně BENG-qTD Na membráně s existujícím membránovým potenciálem  platí : G = - nF (Eh + ) - Pohyb e- vůči napětí na membráně – „z kopce/do kopce“

Elektrochemický potenciál iontu BENG-qTD Platí obecně pro pohyb iontů přes membrány ~ 2 hnací síly: 1) koncentrační gradient 2) membránový potenciál  Koncentrační gradient (přenos z koncentrace [X]A do [X]B) G (kJmol-1) = 2,3 RT log [X]B /[X]A Membránový potenciál (přenos kationtu Xm+ po potenciálu  ): G (kJmol-1) = - mF  Celkový elektrochemický potenciál: Xm + = G = - mF  + 2,3 RT log [X]B /[X]A speciální případ: protony

Elektrochemický potenciál protonů BENG-qTD Pro přenos protonů lze odvodit vztah: H + = - F  + 2,3 RT pH kde pH je definováno jako pH v P-fázi minus pH v N-fázi Historická poznámka: Mitchellova definice protonmotivní síly p (mV) = - (H + / F) H + 1kJmol -1 odpovídá p 10,4 mV p 200 mV odpovídá H + 19 kJ mol -1 Pro 25oC a dosazení konstant: p (mV) =  - 59 pH

Fotony S 1 molem látky interaguje N fotonů: BENG-qTD - primární zdroj G při fotosyntéze * energie fotonu E = h h … Planckova konst. 6,62 x 10-34  … frekvence záření (s-1) S 1 molem látky interaguje N fotonů: G = N h = N hc / = 120 000 / (kJ mol-1) Absorbce 1 molu červeného světla (600 nm) při fotosyntéze: cca G = 200 kJ mol-1

Bioenergetické přeměny a jejich stechiometrie Případ mitochondrií: protonmotivní síla p je „převodníkem“ mezi Eh a GATP in vivo nerovnovážné podmínky (otevřený systém) in vitro lze dosáhnout „rovnováhy“ např. isolované MTCH – rovnováha mezi protonmotivní silou a syntézou ATP – pokud neprobíhá hydrolýza ATP - lze testovat lehkým vychýlením z rovnováhy – reakce musí běžet opačným směrem „Průsak protonů“ MTCH membránou – ustálená hodnota p pod rovnovážnou hodnotou odpovídající Eh (tj. „vždy tečou nějaké elektrony“ z NADH na kyslík)

Čerpání protonů dýchacím řetězcem BENG-qTD Příklad: přechod 2 e- v dýchacím řetězci v redox rozmezí  Eh přečerpá n H+ Rovnováhy bude dosaženo pro: n p = 2  Eh Závěr: - čím vyšší stechiometrie H+/ O, tím nižšího rovnovážného p může být dosaženo (analogie převodů na kole do kopce) Platí pouze pro vstup a výstup e- na stejné straně membrány !!! x přenos succinátdehydrogenasa (matrix) – cyt c (cyt) n p = 2 ( Eh +)

Čerpání protonů při syntéze ATP BENG-qTD Rovnovážný vztah pro syntézu ATP v mtch matrix:  Gp, matrix = n´ F p kde n´… stechiometrie H+/ATP Závěr: - čím vyšší stechiometrie H+/ATP, tím vyšší G lze dosáhnout při daném p (platí i pro bakteriální membrány a stroma chloroplastů) Transport ADP/Pi do a ATP ven z mitochondrií = příspěvek transportní energie pro celkovou energii (n´ je zpravidla mezi 3 a 4)  Gp, cyt = (n´ + 1) F p

Účinnost syntézy ATP Nelze pominout: BENG-qTD „ Oxidace NADH kyslíkem má Go = 220kJmol-1, syntéza ATP má Go=+31kJmol-1 takže pokud na každý NADH jsou syntetizovány 3 molekuly ATP, oxidativní fosforylace zachycuje asi 93 kJmol-1, což je účinnost 42%…“ (nejmenovaná učebnice biochemie) Nelze pominout: v buňce nejsou standardní podmínky ve fyzikální chemii nelze jednoduše spočítat účinnost podílem zdánlivého „výstupu“ a „vstupu“ Realita: Přenos 2 molů e- při oxidaci NADH  p= 200mV a přenos 10mol H+ * energie konzervovaná v protonovém gradientu 10 x 200 x F = 200kJ * při syntéze ATP a přenosu do Cyt  p = 3 x 60 kJ = 180kJ

Nabité molekuly a  BENG-qTD Rovnovážná distribuce nabitých iontů mezi kompartmenty A a B oddělených membránou (pro G = 0) Z rovnice pro elektrochemický potenciál platí za rovnováhy: Xm+ = 0 = - mF  + 2,3 RT log [X M+]B [X M+]A  = 2,3 RT/mF . log [X M+]B - vztah mezi rovnovážnými koncentracemi iontu za daného membránového potenciálu - elektrochemická rovnováha nastává při rozdílných koncentrací !!!

Rovnovážná distribuce kyselin a zásad BENG-qTD A) Membránový gradient a pH gradient na membránách: - vliv na rovnovážnou distribuci permeabilních iontů s disociabilními protony - použití syntetických kationtů pro měření  a pH B) Membránový potenciál generovaný přenosem jednoho iontu ovlivňuje distribuci všech ostatních iontů - např. transport H+  přesun iontů elektrickým uniportem Specifika: * Anionty jsou vypuzovány z negativně nabité matrix * Kationty se akumulují v exponenciální závislosti na  * Dvojmocné kationty akumulují daleko více než jednomocné

Nabité molekuly a  BENG-qTD Rovnovážná distribuce nabitých iontů mezi kompartmenty A a B

Slabé kyseliny/báze a pH BENG-qTD Distribuce neutrální molekuly není ovlivněna  - rovnováha nastane při vyrovnání koncentračního gradientu Slabé kyseliny a zásady (pKa 3-11) * obvykle prochází jako nenabité molekuly x v ionizované formě nepropustné i při vysokém koncentračním gradientu * protonované kys. a deprotonované báze – nezávislost na  * při existenci pH - dochází k rozdělení ionizovaných částic - slabé kyseliny akumulace v alkalickém zóně (matrix) - slabé zásady akumulace v kyselé zóně (mezimembránový)

Další typy membránových potenciálů BENG-qTD Difúzní potenciál - vznik membránového potenciálu přidáním soli, jejíž kation a anion mají rozdílnou permeabilitu membránou (rozdíl od potenciálu tvořeného prací iontové pumpy) např. KCl + valinomycin – vyšší propustnost pro K+ vede ke vzniku  uvnitř částice (lze popsat Nerstovou rovnicí) * na plasmatické embráně eukaryot trvalé difúzní potenciály Povrchový potenciál – konc. H+ v bezprostřední blízkosti membrány je vyšší než v roztoku * neovlivňuje p x může ovlivnit membránově vázané indikátory

Další oblíbená kapitola: Nerovnovážná TD BENG-qTD Další oblíbená kapitola: Nerovnovážná TD

Pokračování příště BENG-qTD