Chemismotický tok protonů

Prezentace na téma: "Chemismotický tok protonů"— Transkript prezentace:

1 Chemismotický tok protonů
BEN - chemi Chemismotický tok protonů 4.ročník - bioenergetika

2 Centrální koncept bioenergetiky
BEN - chemi

3 Otevřený obvod BEN - chemi Nulový proud Maximální napětí (potenciál)

4 Uzavřený obvod průchod proudu = dýchání
BEN - chemi průchod proudu = dýchání konání užitečné práce = syntéza ATP

5 Zkratovaný obvod rozptyl energie ve formě tepla
BEN - chemi rozptyl energie ve formě tepla nízký potenciál x nejintezivnější dýchání

6 Respirační řetězec MTCH
BEN - chemi

7 Rozdělení p na pH a  BEN - chemi Faktory při ustavení protonového gradientu na membráně: a) nízká elektrická kapacita MTCh membrány * přenos 1nmol H+  potenciál 200mV b) pufrovací kapacita matrix * cca 20nmol H+ na mg proteinu na jednotku pH * ztráta 1nmol H+  nárůst pH pouze o 0,05 jedn. Vliv permeabilních látek: Kationty – redistribuce  na pH (průchod K+ snižuje p a to je kompenzováno dalším přenosem H+ = zvýšení gradientu pH) Slabé kyseliny – zrušení pH gradientu a obnovení  * může vést k bobtnání MTCH x neprobíhá v přítomnosti Ca2+ a Pi

8 Rozdělení p na pH a  Zvýšení podílu pH po přidání K+ a ionoforu
BEN - chemi Zvýšení podílu pH po přidání K+ a ionoforu

9 Určení stechiometrie H+/0
BEN - chemi Extrapolace na hodnotu bez průsaku H+ membránou během aerobní fáze Pulsní kyslíková metoda: přídavek malého množství O2 k anaerobní suspenzi MTCH – sledování změny pH rychlou elektrodou

10 Stechiometrie H+/ATP BEN - chemi Stechiometrie H+/ATP - přímo ze struktury F1.F0 ATP synthasy * na 1 otočku katalytické jednotky F1 3 moly ATP * rotor poháněný H+ vyžaduje H+ na 1 otočku tj. odhad poměru 3,3 - 4,7 H+/ ATP - musí souhlasit s TD výpočty z G a p: * exp.hodnoty p ~ mV odpovídají poměru 3-4 Podmínka shody mezi stechiometrií dýchacího řetězce, ATP syntézy a celkové stechiometrie ATP synthesy: ATP/ 2e- = { H+/2e- } { H+/ATP } ATP/ O = {H+/O } { H+/ATP } …. O2 jako finální akceptor

11 Respirační kontrola transportu H+
BEN - chemi „Protonový proud“ JH+ = { O/t } { H+/0 } * přímá úměrnost spotřebě kyslíku * pohodlné určení kyslíkovou elektrodou (Clark ) * jednoduchý model sledování respirační kontroly Podle inkubačních podmínek můžeme sledovat: a) transport substrátu přes membránu b) aktivitu dehydrogenasy pro přísl. substrát c) aktivitu dýchacího řetězce d) transport adeninových nukleotidů e) aktivitu ATP synthasy f) permeabilitu membrány pro H+

12 Protonový proud a respirační kontrola
BEN - chemi Inhibice transportního proteinu ( pro sukcinát) b) Inhibice dehydrogenasy c) Inhibice dýchacího řetězce

13 Protonový proud a respirační kontrola 2
BEN - chemi d) Inhibice transportu adeninových nukleotidů e) Inhibice ATP synthasy

14 Respirační stavy MTCh Konvence sledu respiračních stavů MTCH
BEN - chemi Konvence sledu respiračních stavů MTCH (typický experiment): stav 1: pouze MTCH ( v přítomnosti Pi) stav 2: přídavek substrátu (nízká respirace – málo ADP) stav 3: přídavek ADP (rychlá respirace) stav 4: konec přeměny ADP na ATP (zpomalení respirace) stav 5: anoxie (dnes se běžně používají pouze označení stav 3 a 4)

15 Respirační stavy a poměr P/O
BEN - chemi p

16 Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p
BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2

17 Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p
BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 JH+ = 15 x 6 = 90 nmol H+ min-1 mg-1 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2

18 Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p
BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 JH+ = 15 x 6 = 90 nmol H+ min-1 mg-1 CMH+ = 90/220 = 0,41 nmol H+ min-1 mg-1 mV-1 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2

19 Protonová vodivost Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p
BEN - chemi Protonová konduktance membrány CM H+ = JH+ /p * ústřední parametr chování daného MTCh preparátu Příklad: jaterní MTCh ve stavu 4 – oxidace sukcinátu 1) Typické hodnoty: 15 nmol 02 min-1mg-1, p = 220mV, H+/O = 6 JH+ = 15 x 6 = 90 nmol H+ min-1 mg-1 CMH+ = 90/220 = 0,41 nmol H+ min-1 mg-1 mV-1 2) Po přidání ionoforu FCCP - pokles p na 40mV, nárůst respirace na 100nmol O2 J H+ = 100 x 6 = 600 nmol H+ min-1 mg-1 C MH+ = 600/40 = 15 nmol H+ min-1 mg-1 mV-1

20 Svalová termogeneze Hnědá tuková tkáň B) netřesová (non-shivering)
BEN - chemi Svalová termogeneze A) třesová B) netřesová (non-shivering) * tetanické stahy svalů (včely, čmeláci) * plíce soba – spalování tuků * hnědá tuková tkáň (0.5% hmotnosti x 10-nás. respirace) * hibernace (malí a velcí savci) * novorozenci (termoregulace) * dospělý člověk

21 Zimní spánek a hnědá tuková tkáň
BEN - chemi

22 BAT (hnědá tuková tkáň)

23 Fyziologická kontrola hnědé tkáně
BEN - chemi Fyziologická kontrola hnědé tkáně UCP uncoupling protein změna konformace po vazbě mastné kys. vysoká koncentrace po narození lze indukovat adaptací na chlad nebo přejídáním

24 Fyziologická kontrola hnědé tkáně
BEN - chemi Reakční cela se třemi elektrodami pro měření , respirace, JH+ a CMH+

25 Fyziologická kontrola BAT
BEN - chemi Funkce UCP1

26 Fyziologická kontrola BAT
BEN - chemi Hypotetická role UCP2 a UCP3: obrana proti ROS

27 Přehled významu UCP BEN - chemi

28 Bazální průsak protonů
BEN - chemi Mechanismus: - není vázán na přítomnost nějakého specifického proteinu - nesouvisí s fosfolipidovým složením membrány - pravděpodobný průsak na spojích mezi proteiny a lipidy ? Fyziologický význam: - bazální metabolismus svalové tkáně - průsak je nejvyšší při vysokém p * mohl se vyvinout jako mechanismus limitující max. napětí * omezení vzniku ROS a oxidativního poškození ?

29 Celkové parametry přeměny energie
BEN - chemi Koeficient respirační kontroly - empirický parametr ~ integrita MTCH - poměr respirace při max. a nulové syntéze ATP (typicky 3-15) - u baktérii nízká respirační kontrola Koeficient P/O = mol ATP na 2e- proteklé určitou částí řetězce - pokud je použit jiný terminální akceptor – koef. P/2e- - měřeno po malém přídavku ADP k MTCH ve stavu 4 - je výsledkem hodnot H+/2e- a H+/ATP pro daný substrát a zúčastněné respirační komplexy Přibližné hodnoty: NADH-O2 P/O = 2,5 sukcinát-O2 P/O = 1,5

30 Uměle vyvolaná protonmotivní síla
BEN - chemi Experiment „kyselé lázně“: Inkubace thylakoidů ve tmě a pH 4 Přenos do pH 8 Syntéza ATP ! Považováno za důkaz že pH je schopno pohánět syntézu ATP x uplatňuje se i  (permeabilita pro sukcinát a tvorba difúzního potenciálu)

31 Princip „kyselé lázně“
BEN - chemi - Pro podobný experiment s MTCH nebo bakteriemi je potřeba ionofor pro kompenzaci náboje

32 Rekonstituce protonového obvodu
BEN - chemi světlem-poháněna protonová pumpa

33 Příště: BEN - chemi „Dýchací řetězec“