Protein synthesis, proteolysis, and cell cycle transitions Nobel Lecture, december 9, 2001 TIM HUNT

- studium syntézy proteinů - buněčný lyzát z retikulocytů - změna syntézy proteinů krátce po oplození vajíčka mořské ježovky - kontrola u experimentů - věřit vlastním datům (iniciace translace methioninovým zbytkem); Tony Hunter a Richard Jackson Met-tRNAf; komplex Met-tRNAf a 40S podjednotky ribosomu bez nutnosti mRNA - dsRNA-aktivovaný inhibitor syntézy proteinů, protein kináza PKR; proč musí být RNA krátká

Modelový organismus Arbacia punctulata (ježovka) - vajíčka, embryologické studie - vajíčka před oplozením v G0-like fázi, kompletní meióza v ovariu Spisula (škeble) -vajíčka, embryologické studie - vajíčka zastavená v G2 fázi, dokončení meiózy až po oplození

Objev cyklinů - červenec studium změn složení proteinů v oplozených vajíčkách ježovky a ve vajíčkách aktivovaných vápníkovým ionoforem, A objev specificky cyklujících proteinů → cyklinů - tyto proteiny odbourávány specifickou proteolýzou - kontinuálně syntetizovány a periodicky odbourávány (téměř kompletně) - ve vajíčkách škeble později také identifikovány cykliny - kompletní sekvence cyklinu B z ježovky v r. 1986

- srovnání s cyklinem A ze škeble (Spisula) ukázalo silnou homologii, nepřipomínaly nic ze současné databáze, ne protein kinázy - inhibice DNA syntézy ve vajíčkách ježovky vede ke stabilizaci hladin cyklinů A a B - odbourání cyklinů na přechodu metafáze/anafáze - po vstupu do mitózy mizí nejprve cyklin A, v zápětí cyklin B, běžící proteolýza brání okamžité opětovné akumulaci - později cykliny B1, B2 a A1 objeveny i u žáby Xenopus

Spojení MPF a cyklinů MPF – mitosis promoting factor, dělící se buňky - injekce MPF do buněk vyvolává dělení - u vajíček žáby první meiotické dělení vyvolané MPF nevyžaduje syntézu proteinů, druhé ano → MPF, nebo jeho část proteolyticky odbouráno a musí být znovu syntetizováno - postranslační modifikace MPF – cykliny podjenotka MPF? - programovaná proteolýza jako součást kontroly buněčného cyklu? (ubiquitin-závislá proteolytická degradace) - cyklin A ze škeble způsobí u vajíček žáby to stejné, jako ošetření MPF

- vajíčka škeble obsahující pre-MPF nemají detekovatelný cyklin A, objeví se až s MPF T. Hunt

-purifikovaný MPF z Xenopus vykazoval histon kinázovou aktivitu a obsahoval cyklin B - CDK (cyklin dependentní kinázy) vyžadují ke své aktivaci cykliny, aktivaci komplexu zvyšují CAK (CDK aktivační kinázy) CDK2 navázaná na C-terminální fragment cyklinu A T. Hunt, 2001

Cykliny a kvasinky - sekvence Cdc13 z S. pombe odpovídá cyklinům typu B - Cdc2 a cykliny tvoří komplex