Transkriptom

Analýzy toku informací v buňce Genomové mapování Genomové sekvenování Anotace genomu Strukturní genomika Jádro DNA arraye a čipy (semi) qRT-PCR Northern blot + hybrid. Transkripční fúze DNA (Genom) Funkční genomika Regulace pre-mRNA Cytoplasma mRNA 2D elektroforéza Hmotová spektrometrie Proteinové sekvenování Translačí fůze Immunodetekce Enzymové aktivity, … mRNA (Transkriptom) Proteiny (Proteom) Metabolity (Metabolom) Chromatografie Hmotová spektrometrie NMR

Transkriptom

Transkriptom - soubor všech mRNA přítomných v dané buňce, pletivu, … - odráží míru transkripce genů, alt. sestřih a stabilitu transkriptů Transkriptomika – sledování exprese populací genů, - hledání rozdílů v celkové genové expresi (za různých podmínek, v různých stádiích vývoje, v různých orgánech, …)

Sledování transkripce genů – hladiny mRNA (nejen transkriptomicky) Metody založené na hybridizaci NK (na pevné fázi) Hybridizace na Northern blotu Macroarrays Microarrays/Chips Metody založené na PCR mRNA (Transkriptom) Real time PCR qRT-PCR; Semikvant. RT-PCR DNA (Genome) Proteiny (Proteom) Transkripční fúze promotoru s reportérovým genem reportérový gen P gen T

Semikvantitativní RT-PCR qRT-PCR a Semikvantitativní RT-PCR množství produktu (počet cyklů potřebných k dosažení určité koncentrace) odráží množství výchozího templátu Izolace celkové RNA (mRNA) Semikvantitativní RT-PCR Reverzní transkripce (oligoT či spec. reverze primer) cDNA qRT-PCR omezený počet cyklů - zastavení v exp. fázi

qReal Time - PCR Detekce množství produktu – zpravidla detekce celkové dsDNA - vyšší specifita při použití sond komplementárních k amplifikované sekvenci R …reporter Q …quencher (zhášeč) D … donor A … acceptor

Detekce nukleových kyselin hybridizací (na pevné fázi x in situ, …) sonda (proba) = vlákno NK o známé sekvenci využívané k detekci přítomnosti komplementárních NK v analyzovaném vzorku (směsi izolovaných NK) Hybridizace – interakce komplementárních ssNK – ssNK vázané na pevné membráně (skle) tzv. imobilizovaná (vázaná) fáze – ssNK v roztoku – tzv. mobilní fáze

Značené sond (směsí NK) pro hybridizace - vlákno se zpravidla značí při syntéze, inkorporací značeného nukleotidu Typy značení - radioaktivní (nejčastěji 32P) - fluorescenční značení - digoxygenin, biotin apod. + následná detekce protilátkou/streptavidinem

Hybridizace na Northern blotech Imobilizovaná (vázaná) fáze – analyzovaná směs nukleových kyselin Mobilní fáze = značená sonda (detekce přítomnosti/množství jedné sekvence + informace o velikosti sekvence) x hybridizace na DNA čipech (arrayích) Imobilizovaná (vázaná) fáze – lokalizovaně vázané sondy (úseky DNA o známé sekvenci) Mobilní fáze = značená směs analyzovaných nukl. kyselin (detekce přítomnosti/množství velkého počtu sekvencí)

Hybridizace na Northern blotu Izolace RNA Rozdělení na elektroforéze Macroarrays Přenos RNA z gelu na membránu - blotování Hybridizace se značenou sondou v roztoku, detekce

(imobilizovaná sonda) DNA arraye a DNA čipy - princip Fluorescenčně (RI) značené analyzované NK (mobilní fáze) Hybridizace Fluorescenční (RI) signál Pozice Identita Síla signálu Množství Array, Čip (imobilizovaná sonda)

Definice pojmů: array, čip Příprava Podklad Hustota [probes/cm2] Membrána max. 64 Nanášení oligo-nucleotidů nebo PCR fragmentů Macroarray (High Density Array) např. sklo až 104 Nanášení oligo-nucleotidů nebo PCR fragmentů Microarray např. sklo Chip Přímá syntéza na podkladu (fotolitografie) až 2.5 *105

Arraye Próby Mobiní fáze (nejčastěji značená cDNA) Imobilizovaná fáze (array) cDNA (EST) Próby Genomové sekvence Oligonukleotidy, …

Příprava mikroarrayí nanášením - contact printing MicroGrid II (Biorobotics) až 64 jehlový nástavec (Telechem) Hustota: až 6400 prób na cm2 na až 108 sklíčkách oligonukleotidy a DNA fragmenty až 12 kb 4.5 mm

Porovnávání genové exprese na mikroarrayích pomocí diferenciálního značení vzorek I Hybridizace se směsí Izolace RNA Značení (např. při syntéze cDNA) vzorek II Alternativa: nezávislé hybridizace a porovnání arrayí

Identifikace diferenciálně exprimovaných genů - statistické hodnocení odlišnosti

Problémy při použití arrayí Nespecifické (cross-) hybridizace, pozadí Absolutní intenzita signálu závislá i na sekvenci (účinnosti hybridizace), nejen na množství komplementární NK Reprodukovatelnost Řešení: každá próba na více pozicích na čipu více prób od každého genu čipy Affimetrix

Syntéza – využívá fotolithografii Oligonukleotidový čip Affymetrix více prób na každý gen (např. 20 párů) – složitá pravidla pro navrhování, složení a výběr sekvencí, syntéza přímo na čipu - próby z 3' konce genů (vhodné pro Eukaryota) Syntéza – využívá fotolithografii

Oligonukleotidový čip Affymetrix každý oligonukleotid v přesné verzi a s jedním změněným nukleotidem mRNA sekvence 5‘ 3‘ Páry DNA prób Sekvence genu Dokonale párující oligo Chybně párující oligo Buňky s dokonalým párováním Záznam intenzity fluorescence Buňky s chybným párováním Rozdíl v intenzitě fluorescence mezi „dokonale párující buňkou” a „chybně párující buňkou” je analyzován pro všechny dvojice prób - páry s nízkou informační hodnotou

RNA pro hybridizaci s čipem Značení sondy pro čipy Affymetrix Celková RNA nebo polyA mRNA je reverzně transkribována na cDNA a lineárně amplifikována in vitro transkripcí do cRNA (za současného naznačení biotinem) mRNA reverzní transkripce AAAAAAAAA TTTTTTTTTT- T7 promoter cDNA s T7 promoterem AAAAAAAAA připojení T7 promotoru in vitro transkripce RNA pro hybridizaci s čipem biotinem značená cRNA B fragmentace UUUUUUUUU B

Čipy Affymetrix - hybridizace a analýza výsledku Po hybridizaci je na biotin navázán konjugát streptavidinu s phycoerythrinem a je nasnímána a analyzována intenzita fluorescence analýza obrazu B B B B B B B B B B značení streptavidin- phycoerythrinem B pseudokolorovaný obraz detector promytí a nasnímání emise při 570 nm B excitace při 488 nm monochromatický obraz

Genevestigator https://www.genevestigator.com přístup k čipovým datům - analýzy exprese jednotlivých genů např. Arabidopsis - výběr organismu výběr genu(ů) výběr čipů (experimentů)