RADIAČNÍ POŠKOZENÍ KREVNÍCH BUNĚK I. Cíl: Modelování akutní nemoci z ozáření I. stupně - krevní formy změny parametrů KO + diferenciál změny hmotnosti vybraných orgánů změny tělesné hmotnosti

Ionizující záření způsobuje ionizaci elektroneutrálních atomů a molekul (přímo nebo sekundárně vzniklými elektrony): elektromagnetické záření ( a RTG) korpuskulární záření  (heliová jádra)  (elektrony) mezony neutrony

Elektromagnetické záření: - schopno pronikat do hloubky a ionizovat při průchodu tkáněmi Korpuskulární záření: - průnik je limitován nábojem, rychlostí a hmotností částic

Dávky záření Velikost účinku: absorbovaná dávka (J/kg) - gray (Gy) 1Gy = 100 rad Různá biologická účinnost dávkový ekvivalent (J/kg) – sievert (Sv) Q - faktor kvality záření: gama: Q=1 neutrony: Q=10  částice: Q=20

Teorie o účincích ionizujícího záření 1. Zásahová teorie v každé buňce je citlivý terč, jehož zasažení vede jejímu poškození exponenciální závislost mezi efektem a dávkou = jeden terč sigmoidální závislost = více terčů (více zásahů) N (přežívajících) = n  N0 e-vD

2. Teorie nepřímého účinku (radikálová) Záření vyvolává přímo či nepřímo tzv. excitaci molekul (přechod elektronů na vyšší energetické hladiny) uvolněné protony pronikají do protoplazmy a dochází ke vzniku iontových párů reagují hlavně s vodou  vznik volných radikálů (.H) a (.OH) při interakcích vznikají reaktivní formy H2O2 a (.HO2) interakce s nukleovými kyselinami, enzymy, membránami  poškození DNA

3. Teorie duálové radiační akce Předpoklady: prvotní vyvolání sublézí - počet je přímoúměrný sdělené energii, odpovídají tzv. absorpčním aktům (diskretním interakcím částic záření s látkou) primární biologická léze vzniká kombinací dvou sublézí efekt = aD + bD2 + c relativní biologická účinnost: poměr efektivní dávky řídce a hustě ionizujícího záření

4. Molekulárně biologická teorie poškození je kombinací dvou primárních dějů - buď v průběhu dráhy jedné částice - nebo je každý vázán na průchod jiné částice přesně definuje terč vliv biochemických procesů a stavu buňky (reparační mechanizmy) manifestace efektu není s poškozením vázána deterministicky, ale pravděpodobnostně N = D + D2

Účinky záření na buňku buňky zmírají mitotickou, postmitotickou smrtí (x lymfocyty, zárodečné buňky) průměrná letální dávka je několik Gy (x stovky Gy pro biochemickou smrt) ústřední poruchou - poškození DNA (změny membrán, zpomalení průchodu buněk jednotlivými fázemi cyklu - využití v radioterapii) nemusí způsobit zánik buňky - změny genetické (genové x chromozomové mutace) (gametické x somatické mutace)

Radiosenzitivita buněk přítomnost kyslíku, endogenních thiolů (-SH zvl. glutathiol) v okolí DNA - hypoxie = cca 3 x radiorezistentnější výkonnost enzymatických reparačních mechanizmů fáze buněčného cyklu (nejcitlivější v mitóze, rezistence v pozdní S-fázi)

Účinek ionizujícího záření na tkáně nutná znalost cytokinetiky tkáně - rychlost vtoku buněk (trvání buněčného cyklu a růstová frakce) - odtok buněk (ztráty) čas potřebný k tomu, aby se projevilo poškození, závisí na zmíněných cytokinetických parametrech  obvykle je určitá funkční rezerva

Hematologické změny u pacientů po dávce 4.3 Gy

Účinky ionizujícího záření na člověka nestochastické: - akutní nemoc z ozáření - akutní lokalizované poškození - poškození plodu in utero - pozdní nenádorová poškození stochastické - zhoubné nádory - genetické změny

Akutní nemoc z ozáření (akutní postradiační syndrom) následkem ozáření celého těla či jeho podstatné části 3 formy - liší se klinicky i mortalitou všechny fáze mají prodromální příznaky, období latence, období vystupňovaných příznaků a pokud nemocný přežije - období rekonvalescence délka latence i způsob manifestace - závisí na velikosti ozáření

Neurovaskulární syndrom vznik po dávce několika desítek Gy ( 50 Gy) krátká prodromální fáze (nauzea, zvracení) rychlý nástup letargie, apatie, ataxie, záchvaty (grand mal) rezistentní hypotenze, arytmie, šok smrt v rozmezí 24 - 48 hod

Gastrointestinální syndrom vznik po dávce kolem 10 Gy prodromy: anorexie, nauzea, zvracení latence 3 - 7 dní Úporné zvracení, průjmy, známky dehydratace (dány úvodní toxémií z nekróz tkání a pokračující atrofie střevní sliznice) zmenšení plazmatického volumu, oběhové selhání terminálně - nekrózy střevní sliznice, masívní ztráty plazmy do střeva, smrt

Hemopoetický syndrom po dávkách 3 - 5 Gy (hraničně po dávkách 1 - 2 Gy) prodromy: anorexie, nauzea, meningeální dráždění, zarudnutí kůže a spojivek (mizí do 36 hod) období latence (1 - 2 týdny) známky porušené obranyschopnosti a krvácivé projevy - sepse, krvácení, poškození sliznic fáze rekonvalescence 4. - 8. týden (úprava do roka)

Laboratorní nálezy okamžitá lymfopenie (extrémní citlivost - intermitotická smrt, glukokortikoidy) zmnožení neutrofilů (obraz zánětlivé reakce s vyplavením granulocytů ze dřeně) pomalejší nástup trombocytopenie ještě pomalejší pokles Ery, Hb, Htk...

Praktikum potkani kontrolní a dvě skupiny ozářených (po 3 a 20 dnech) zvážení zvířete (v éterové anestezii) odběr krve ze srdeční komory 2 nátěry zbytek krve do zkumavky odběr a zvážení slezin

Náš úkol Stanovení: Příprava periferního nátěru: - počtu erytrocytů - množství hemoglobinu - hematokritu - počtu leukocytů - počtu trombocytů Příprava periferního nátěru: - pro počítání diferenciálu - pro počítání retikulocytů

Stanovení počtu Ery do baničky s Hayemovým roztokem - 25l krve 2 - 3 minuty protřepáváme naplníme Bürkerovu komůrku počítáme ve 20 obdélnících a vypočítáme: T=Σ20 x 10 000 (počet/l)

Stanovení hemoglobinu hemiglobinkyanidová metoda (oxidace roztokem ferrikyanidu draselného) 25l krve do roztoku (dle Drabkina) 10 minut necháme stát měříme absorbanci v kyvetě proti Drabkinově roztoku z kalibrační křivky odečteme konc. v g/l

Stanovení hematokrytu naplníme kapiláry délky 75mm krví centrifugujeme 3 min při 100 000 g odečteme pomocí odečítacího zařízení

Počítání leukocytů do baničky s 475 l Türkova roztoku - 25l krve 2 – 3 min necháme stát protřepeme a naplníme Bürkerovu komůrku počítáme v 50 čtvercích a vypočítáme T=Σ50 x 100 (počet/l)

Počítání destiček do baničky s prokainem - 25l krve 20 minut čekáme na hemolýzu erytrocytů protřepeme a naplníme Bürkerovu komůrku počítáme ve 20 obdélnících a vypočítáme T=Σ20 x 1000 (počet/l) u člověka 150 - 300 tis./l, u potkana cca 600 tis./l

RADIAČNÍ POŠKOZENÍ KREVNÍCH BUNĚK II. Cíl: Pokračováním praktika z minulého týdne je zhodnocení periferního krevního nátěru

1. Počítání retikulocytů mladé erytrocyty - nelze prokázat v nativním stavu  brilantkresylová modř v erytrocytu se objeví modrá vlákna a zrna (substantia reticulofilamentosa - zbytky ribonukleové kyseliny v plazmě) podle množství zrn s sítě se dále rozeznávají méně či více zralé retikulocyty v krvi u člověka je: 0.5-1.5% (5-15%O) retikulocytů

Hodnocení počítáme s imerzí, 100 násobné zvětšení spočítá se 1000 ery a zaznamená se, kolik je retikulocytů Norma: kolem 20 %O retikulocytů v krvi potkana  počtu: zvýšená krvetvorba (regenerace) ery  počtu: útlum tvorby erytrocytů

2. Diferenciální rozpočet bílých krvinek určuje se v nátěru obarveném Leukodifem Počet jednotlivých druhů se určuje nejméně na 100, přesněji na 200 leukocytů  počítá se procentuelní zastoupení

Nátěr - prohlížet meandrovitě Prohlížení nátěru Nátěr - prohlížet meandrovitě rozložení leukocytů v nátěru není stejnoměrné větší leuko : na okrajích (mono, Eo) menší leuko: ve středu (lymfo)

Diferenciální rozpočet u laboratorního potkana Počet leukocytů............cca 12.5 tis.mm-3 - neutrofilní granulocyty 18 - 36% - eosinofilní granulocyty 1 - 4% - bazofilní granulocyty 0 - 1% - lymfocyty 62 - 75% - monocyty 1 - 6%

Myeloická vývojová řada Myeloblast Promyelocyt (objeví se granula) Myelocyt (granula jasně diferencovaná) Metamyelocyt Tyčka (nesegmentované jádro) Segment (členěné jádro)

Monocytární vývojová řada Monoblast Promonocyt Monocyt - velká buňka, bohatá na plazmu, jádro s řídkou vláknitou stavbou, chudé na chromatin, tvar podkovy, fazole nebo laločnaté uložené excentricky

Lymfatická vývojová řada Lymfoblast Prolymfocyt Lymfocyt - malý: 80-90% všech lymfo plazma tvoří jen úzký bledě modrý lem kolem jádra (srpek měsíce) jádro okrouhlé, tmavé - velký: více plazmy, méně hutné jádro

Závěr: výsledky vyšetření periferní krve (všech testů a hodnot) zaznamenat do tabulky porovnat rozdíly mezi skupinami ozářených zvířat s různým časovým odstupem (3, resp. 20 dní po dávce 4 Gy celotělově) a skupinou kontrolní diskuse výsledků