Suspenzní kultury

Způsoby kultivace rostlinných pletiv a buněk na tekutých médiích?

stacionární (můstky, buničitá vata, čedičová vata, polyuretanová pěna, membrány apod.) provzdušňovaná - řepačky - klinostaty - míchaná - probublávaná

Rostou a dělí se několikanásobně rychleji než kultury na pevných médiích Využití: jako experimentální model K produkci sekundárních metabolitů K indukci somaklonální variability a následné selekci K mikropropagaci (pod kontrolou genetické stability)

Měření a regulace průběhu procesu v bioreaktorech Během procesu se měří F a FCH činitele: fyzikální: teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu, příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin fyzikálně-chemické: pH, redox potenciál, množství rozpuštěného kyslíku (kyslíková elektroda), chemické činitele (měření koncentrace stimulátorů a inhibitorů růstu nebo tvorby produktů – C, N, P, S, Mg, K, Na , Fe, regulátory růstu, prekursory…, měření koncentrace NH4+, Mg2+, Na+, Ca2+ PO43- atd. specifickými elektrodami)

Možnost ovlivnění tvorby sekundárních metabolitů Elicitory abiotické: např. Methyljasmonát (MeJA), polyethylenglykol (PEG) Biotické: buněčné stěny bakterií Prekursory Adsorbenty

mikropropagace

Zařízení pro speciální kultivační režimy (Inkubátory, třepačky, rolery, bioreaktory)

Inkubovaná třepačka Amplituda otáčky (rpm)

Roller Pomalé šetrné otáčení 5-60 revolution per hour (do 1 rpm) jen pro buňky, ulpívající na stěnách nádoby

Kultivační láhev s míchadlem Pro suspenzní kultury 100-250 rpm 1-12 litrů (Techne, Sigma)

bioreaktor 20l - Panax ginseng za 8 týdnů 200x Sung Ho Son, Korea

Bioreaktory firmy VitroSys Inc Bioreaktory firmy VitroSys Inc. Korea - kapacita 20000litrů (20t) (celkem 160000litrů)

Ideální suspenzní kultury Vysoký stupeň separace buněk (+auxiny, - vitamíny) Homogenní morfologie buněk Zřetelná jádra a hustá základní cytoplazma buněk Malý výskyt diferencovaných pletiv (tracheální elementy) Rychlý nástup zdvojení populace (24-72 hod) Karyologická stabilita

Vznik Z kalusu Z homogenizovaných diferencovaných pletiv Z protoplastů

Inokulace/ rychlost růstu Minimálně 103 /ml buněk 1/10 suspenze v exponenciální fázi se doplní čerstvým médiem Koncentrace sacharidů prodlužuje periodu růstu

Sledování suspenzních kultur sledování změn pH spotřeba kyslíku Vodivost média Růst Životnost Genetická stabilita kontaminace

Sledování růstu hmotnost buněk (čerstvá a sušina) Množství buněk (ošetření pektinázou – Bürkerova komůrka) Podíl objemu buněk a média (pocket cell volume) 10 min při 100rpm (sedimented cell volume) 30 min Obsah proteinů nebo RNA (µM na počet buněk) Analýza obrazu

Počítání buněk v suspenzi Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož okraje musí pevně přilnout k podkladu Pipetou odeberte 10 µl suspenze buněk a kápněte ji ke hranám krycího sklíčka po obou stranách (tedy 2 x 10 µl). Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv 6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem. Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává vzorec: d = p . 104 / n kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány.

Studium životnosti (viability) suspenzní kultury Mrtvé buňky – prostupnost membrány pro PI, Evans Blue apod. Živé buňky – aktivita emzymů Esterázy (FDA) Respirační schopnost mitochondrií (tetrazoliové soli)

Test viability Tabák BY2 FDA + PI FDA PI

Analýza obrazu Yasuomi Ibaraki (2006) Plant Tissue Culture Engineering

Genetická stabilita Díky rychlému dělení obecně lepší než u kalusových kultur V případě mikropropagace nutné periodicky prověřovat V případě změn založit kulturu znovu ze základní kultury

kontaminace Vzhledem k podmínkám umožňujícím rychlé dělení buněk se rychle rozvíjejí i případné kontaminace, nutno mít pod kontrolou

Protoplastové kulury

Izolace a kultivace Z listového mezofylu, růstových vrcholů, děloh, hypokotylů, kalusu nebo suspenzní kultury

postup Povrchová sterilizace explantátu Narušení - odstranění spodní epidermis, přesátí Inkubace v médiu s enzymy (pektinázy, celulázy) Promytí promývacím médiem s osmoticky aktivními látkami (glukóza, manitol, sorbitol, sacharóza, xylóza) Kultivace, regenerace buněčné stěny, indukce dělení buněk Tvorba kalusu a regenerace rostlin

2 měsíce Čerstvě izolované protoplasty karafiátu (Nakano a Mii, 1992) 30m 5 dní

1 měsíc -regenerační medium 1cm

Regenerované rostliny (D. chinensis)

E kalus odvozený ze zralého ZE rýže ( Datta 1992) Čerstvě izolované protoplasty E suspenze

E suspenze Konverze SE Rýže z protoplastové kultury