Analýza a třídění chromozomů Pavlína Kovářová Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc http://www.ueb.cas.cz/olomouc1

Průtokový cytometr Analýza: Mikrospóry Protoplasty Buněčná jádra BD FACSVantage (2 lasery, 8 parametrů) Analýza: Mikrospóry Protoplasty Buněčná jádra Chromozómy Chloroplasty

. Schéma průtokového cytometru Průtoková komora Elektrický Vzorek pulz Unášecí tekutina Regulátor tlaku Průtoková komora + - Sběrná zkumavka Vzorek Vychylovací destička Elektrický pulz Laser Ted jen takove male opakovani, protože toto uz jste videli v predbasce docenta dolezela. Hlavni vasti kazdeho prutokoveho cytometru je prutokova komora, do které je privaden v zorek a unaseci tekutina. Hydrodynamickou fokusaci se chromozomy dostavaji do centralni oblsti vodniho paprdku opustejicího trysku. Po inchromozomy procházeji zdrajem excitacniho zareni, kterym byva laser.po interakci s exc. Paprskem dochazi nejen k emisi fluorescence a,le taky k rozptylu, které jsou detekovany detektory. je emitovana fluoresce a

Princip třídění Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl Detektor Laser Vychylovací destička Odpad Do leva tříděné kapky Do prava Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl Společná analýza osmi parametrů Rychlost třídění (102 – 104 chr./ sec)

Příprava suspenze chromozomů Materiál používaný k přípravě suspenze chromozomů: Buněčné kultury Protoplasty listového mezofylu Meristemy kořených špičky Extrakce chromozomů Příprava Buněčná synchronizace Akumulace v metafázi Barvení chromozomů Vzorkem pro cytometrickou analýzu je suspenze intaktních chromozomů. Tato susoenze může byt pripraveny z bunecne kultury, jeji nevyhodou je karyologicka nestabilita nebo z protoplastu listoveho mezofylu, pro který je typicka mala uroven synchronizace. Velmi vyhodne je pripravovat vzorky z meristemu korenovych spicek, jtere jsou karyologicky stabilni a jsme u nich schopni dosahnout vysoke urovne synchronizace.priprava samotneho vzorku je velmi zdlouhava a zahrnuje bunecnou synchronizaci……………………… Cytometrická analýza Třídění chromozomů

Flow karyotyp Idiogram Relativní obsah DNA Frekvence Flow karyotyp vyjadřuje závislost relativního obsahu DNA na počtu daného typu chromozomů Detekce strukturálních a početních změn chromozomů v karyotypu Teoretický flow karyotyp

Hexaploidní pšenice (1C = 17 000 Mbp) Flow karyotyp Relativní intenzita fluorescence Relativvní frekvence Chinese Spring I II III I: 1D, 4D, 6D; II: 1A, 3A, 6A, 2D, 3D, 5D, 7D; III: 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 2B, 4B, 5B, 6B, 7B 3B Identifikace a určení čistoty tříděné frakce : FISH PRINS PCR Vrana et al. (2001)

Diskriminace jednotlivých chromozomů Použití chromozomových linií : Translokační linie Deleční linie Adiční linie Specifické chromozomové barvení AT a GC nukletidových bazí V

Třídění translokačních linií u pšenice „Cappelle Desprez“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 3B I II III „Jubilar“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence I II III 3B 4AL·4AS-5BL 5BL·7BL 5BL·7BL Kromě chromozomu 3B je v histogramu oddělený pík pro translokační chromozomy 5BL·7BL a 4AL·4AS-5BL, které můžeme snadno třídit. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem. Kubalakova et al. (2002)

Třídění chromozomových ramen u pšenice „Chinese Spring“ Dt1BS „Chinese Spring“ iso5BL I 1BS I iso5BL III 1BS III II II Relativní frekvence Relativní frekvence 3B 3B iso5BL Relativní intenzita fluorescence Relativní intenzita fluorescence Jednotlivá ramena chromozomů můžeme třídit z ditelosomockych linií nebo z linií nesoucích izochromozomy. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem Kubalakova et al. (2002)

Adiční linie pšenice a žita Secale cereale „Selgo“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 5BL·7BL 1R - 6R T. aestivum (21'' + 1'' 6R) Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 6R 3B II III I Jednotlivé chromozomy žita mohou být tříděny z adiční linie pšenice–žito. Tříděné žitné chromozomy jsou identifikovány FISH s pSc119.2 repeticí a GAA mikrosatelitem. Kubalakova et al. (2003)

Detekce vzácných strukturálních změn genomu Průtoková cytometrie umožňuje analýzu velkého množství chromozomů (<103) a tím detekci vzácných strukturálních změn. Secale cereale „Adams“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 2R - 7R 1R B 119 Afa Translokace BS·BL-1RS 5S 45S Afa DAPI Tato translokace byla detekována u 0.5% tříděných B chromozomů ¨¨ Kubalakova et al. (2003)

“High-resolution” FISH na natažených chromozomech Tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100 x větší délku, než byla ta původní, čímž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády. PI BAC9 17 μm (1x) 1352 µm (79.5x) 42 µm Chromosome 3B (T. aestivum) Tříděné chromozomy využíváme k fyzickému mapování. Významnou metodou je FISH na natažených chromozomechˇpomocí které tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100x větší délku než byla ta původní., čimž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády. Na obrázku máme modelovou situaci, zde je chromozom, na kterém máme zlokalizovaný BAC. Na normálních chromozomech máme dva od sebe téměř neodlišitelné signály. Na natažených chromozomech vidíme, že už se tyto Bacy nacházejí v určité vzdálenosti od sebe a po zvětšení této oblasti vidíme, že se mezi oběma těmito bayc nachází oblast, která asi nesoucí pravděpodobně nějaké nekodující sekvence. Valarik et al. (v tisku)

Fyzické mapování pomocí PCR se specifických primerů Třídění I II III IV Standartní karyotyp 1 2 3 4 I II Translokace 5 6 Gelová elektroforeza PCR 1 2 3 4 5 6 K fyzickému mapování můžeme použít PCR se specifickými primery. Ze standartního karyotypu si natřídíme jednotlivé chromozomy a provedeme pCR. PCR produkt nám ukazuje, že marker se nachází na chromozmu dve. V případě, že chceme určit, v klteré části chromozomu se tento marker nachází je velmi významné použití translokačních linii s timto chromozomem. Opet na těchto translokovanzch chromozomech provedeme PCR a opet z PCR a z povahy translokace zjistime , na kterem rameni a v které casti chromozomu a marker nachazi. Třídění 102 chromozomů trvá jen několik minut, proto je PCR velmi výhodným nástrojem k fyzickému mapování.

3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice: Konstrukce chromozomově specifických BAC knihoven Cytometrická analýza a třídění I II III 3B Chinese Spring Ligace do defosforylovaného BAC vektoru E. coli transformace Kolonie Uspořádání na 384-jamkové destičky l 1 2 3 S 3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice: 3B chromosomově-specifická BAC knihovna 1D, 4D, 6D subgenomicka BAC knihovna BAC knihovna specifická pro chromozomové rameno 1BS kbp - 2200 BAC knihovny jsou v současné době považovány za výchozí materiál pro sekvenovaní genomu a pro izolaci genů. Výhodou je vysoká stabilita inzertu a jejich velikost, která se pohybuej okolo 100 kbp. Naopak problémem genomických knihoven připravených z rostlin z velkým genomem je, že mají velký počet klonů. Například genomická knihovna pšenice má více než 1000 000 klonů a využití a uchování takové knihovny je značně problematické, proto metoda BAC knihoven z jednotlivých částí genomu tzn. z jednotlivých chromozomů je velmi výhodná. Tato knihovna byla tedy konstruována z 3B chromozomu, z keterého byla vyizolována vysokomolekulární DNA.Po parciálním štěpení se vyizolovaly fragmenty o velikosti 50-250 kbp, ty byly klonovány do BAC vektoru, transformovány do bakterie. Na základě modrobíle selekce byly vybrány rekombinantní klony a sesbírány robotickým zařízením. Reprodukovatelnost této metody byla potvrzena konstrukcí subgenomické BAC knihovny zahrnující chromozomy 1D, 4D a 6D, tyto chromozomy byly vytříděny z prvního píku flow karyotypu. Obrovským úspěchem je konstrukce BAC knihovny specifické pro chromozomové rameno 1BS, která poukazuje na to, že jsme schopni připravit BAC knihovnu, z kterékoliv části genomu. - 825 Izolace vysokomolekulárni DNA - 225 - 50 Šafář et al. (přijato do tisku); Janda et al. (v přípravě)

Fyzické mapování BAC klonů na tříděné chromozomy V BAC knihovně hledáme specifické klony, které mapujeme na mitotických chromozomech pomocí in situ hybridizace. Vysoce repetitivní BAC Tříděné 3B chromozomy 63C11 63B13 63N2 81B7 V naší laboratoři využíváme BAC knihovny ke fyzickému mapování BAC klonů na tříděné chromozomů. Po hybridizaci s genomickou DNA byly vybrány potenciální LOW copy nebo single copy, které byly mapovány pomocí metody FISH na tříděné chromozomy. NA tomto obrázku máme natříděné 3B chromozomy na kterých jsou hzamapovány BAC klony. Je pravděpodobné, že tyto BAC klony nesou kodující sekvence a v současné době se chystáme tyto BACY sekvenovat. Filtr po hybridizaci s genomickou DNA BAC DAPI Málo repetitivní BAC

Závěr Průtoková cytometrie může být použita ke třídění mitotických chromozomů zemědělsky významných obilovin a leguminóz. Flow karyotyping je vhodný ke kvantitavní detekci numerických a strukturálních změn chromozomů Tříděné chromozómy jsou vhodné pro fyzické mapování použitím FISH, PRINS and PCR Tříděné chromozomy lze využít ke konstrukci chromozomově specifických BAC knihoven

Naše laboratoř http://www.ueb.cas.cz/olomouc1