Molekulární diagnostika septických stavů Miloš Dendis

Molekulární diagnostika septických stavů Molekulární diagnostika septických stavů je bezesporu největší výzvou rutinní molekulární diagnostiky dneška O systémovém řešení molekulární diagnostiky sepsí se mluví od té doby, co bylo zavedeno první PCR diagnoszikum pathogena, přičmž dodnes je to spíše přáním než realitou. Přes několika málo vlaštovek o zavedení CE-IVD diagnostik, tato problematika setrvává ve fázi home-made metod více na poli výzkumu než rutinní praxe

27% (sepse) – 54% (septický šok) Molekulární diagnostika septických stavů Vysoká mortalita Incidence (EU) 90,4 případů / 100 000 obyvatel Mortalita (JIP) 27% (sepse) – 54% (septický šok) Náklady na léčbu 7,6 mld EUR/rok PROČ je diagnostika septických stavů tak zajímavá 10. nejčastější příčina smrti v USA a nejčastější příčina smrti na JIP V USA umře 250 000 lidí ročně - to je jako kdyby jste hodili atomovku na 10 měst velikosti Pardubic ročně

neinfekčního SIRS a infekční SEPSE Molekulární diagnostika septických stavů Identifikace SEPSE SIRS (systemic inflamantory response syndrome) teplota <36°C anebo >38°C HR >90/min. tachypnea >90/min nebo PaCO2 < 4,3 kPa WBC <4000b/ul anebo >12000b/ul anebo 10% nezralých forem SEPSE příznaky SIRS + průkaz pathogena Senzitivní a spolehlivý průkaz kauzálního mikroorganismu je klíčový v rozlišení neinfekčního SIRS a infekční SEPSE K čemu slouží diagnostika patogenů SIRS - Syndrom systémové zánětlivé reakce Sepse je syndrom systémové zánětlivé odpovědi vyvolaný infekčním procesem. Problémem je, že jediným rozdílem mezi klinickými příznaky SIRS a SEPSE je právě pozitivní průkaz infekčního agens. Přičemž terapeutický postup se v obou případech diametricky liší … naupak u pacienta, u kterého selže diagnostický proces pouhé tlumení příznaků SIRS může mít fatální důsledky Důležité je tedy disponovat spolehlivou metodou pro průkaz infekčních agens způsobujících sepsi

Rychlost Molekulární diagnostika septických stavů S každou následující hodinou neléčené sepse vzrůstá mortalita o 8% Klíčový požadavek na diagnostickou metodu - rychlost Kruciálním faktorem snižující mortalitu je rychlost s jakou je možno infekční agens detekovat Rychlá identifikace původce sepse vede k nasazení cílené terapie, signifikantně snižuje mortalitu, dobu hospitalizace a celkové náklady na léčbu

Hemokultivace Molekulární diagnostika septických stavů Jako zlatý standard hraje ústřední roli v identifikaci pathogenemie u pacientů s příznaky SIRS a tím v identifikaci SEPSE Vysoká analytická sensitivita Časová náročnost (dny) Nižší spolehlivost - falešně negativní výsledky způsobené předchozím nasazením ATB, nutričními nároky mikroba a jeho viabilitou časová náročnost (2-3 dny) a v případě pomalu rostoucích baktérií a hub doba kulzivace přesahuje týden (kultivace, subkultivace, pomalu rostoucí mikroorganismy) A zde vzniká poptávka po rychlých a kultivačně nezávislých metodách průkazu patogena

Kultivačně nezávislé metody Molekulární diagnostika septických stavů Kultivačně nezávislé metody Rychlost (hodiny) Vyšší spolehlivost - nezávislost na viabilitě detekovaného mikroorganismu, jeho nutričních nárocích a délce životního cyklu Správná indikace Správný odběr a jeho načasování Metodická nejednotnost a pracnost Nízká analytická sensitivita Časté kontaminace Problematická interpretace Aktuálně není uspokojivě vyřešena žádná část celého diagnostického procesu. Od správné indikace k vyšetření, přes metodiku odběru vzorků a jeho načasování, vlastní diagnostický proces až po interpretaci získaných výsledků. O čemž svědčí neexistence standardizovaných paltforem, na základě kterých by bylo možné provést multicentrické studie, které by definovaly spolehlivost těchto nových/starých metod

hybcell Bacteria DNA xA Molekulární diagnostika septických stavů Komerční výrobci   SeptiFast multiplex real-time PCR 25 nejč. původců SepsiTest™ universal + sequencing jakýkoliv Magicplex™ 27 nejč. původců + 3 rezistence hybcell Bacteria DNA xA hybcell Fungi DNA xA universal PCR compact sequencing I když první vlaštovky tady jsou. Pouze CE-IVD, uméžňující detekcí přímo z krve SIRS-lab VYOO – koupena Analytic Jena a už o nich nikdo neslyšel MOBIDIAG, BIORON, BIOFIRE detekce z pozitivních hemokultur Plex-ID - ABBOT – není CE_IVD – Highly precise mass soectrometry Přestože na trhu již jsou výrobci CE IVD diagnostik, přes vysokou poptávku po nich, nedošlo k zavedení těchto diagnostik do rutinní praxe. Proč? Vysoká cena vyšetření – iniciální investice + režijní náklady - vede k tendenci v rámci úspor obcházet základní doporučení a tím znehodnocení výsledku Komplikovaná metodika – nároky na odborný laboratorní personál (je schopno lab. Personál uštvat – vzhledem k urgentnosti je nutno provádět několik diagnostických cyklů denně) – pomohla by automatizace celého procesu Z důvodu nejednotné metodiky chybí multicentrické studie, které by prokazovaly užitečnost těchto vyšetření a poskytovaly základní doporučení, jak vyšetření provádět a výsledky interpretovat

Indikace k vyšetření a správný odběr Molekulární diagnostika septických stavů Indikace k vyšetření a správný odběr Pro detekci patogenu v krvi je bezpodmínečně nutný fakt, že patogen musí být v odebrané krvi přítomen Bakteriémie je dynamický proces a bakterie jsou do krevního řečiště uvolňovány v časových intervalech, s různě dlouhými klidovými obdobími Hlavní roli zde má načasování odběru krve Molekulárně diagnostické metody by měly kopírovat mikrobiologická schémata indikace a odběru vzorků Chleba se láme úplně na začátku celého řetězce diagnostického procesu Poučme se od našich kolegů mkrobiologů

Indikace k vyšetření Molekulární diagnostika septických stavů Nízká pravděpodobnost bakteriemie ambulantní pacienti, cellulitis, community-acquired pneumonia and community-acquired fever. Střední pravděpodobnost bakteriemie pyelonephritis Vysoká pravděpodobnost bakteriemie sepse, septický šok, akutní bakteriální meningitida Pro indikaci vyšetření by mělo být bráno v ohledu především splnění kritérií SIRS. Pouhá horečka anebo leukocytóza nejsou indikací pro výtěžnou hemokulturu. Pro výtěžnou hemokulturu je kritické správně definovaná diagnoźa a klinická kritéria cellulitis (zánět podkoží) 2% - septic shock 69% Pyelonephritis – zánět ledvin S vyjímkou imunokompromitovaných pacientů aendokarditid Coburn B, Morris AM, Tomlinson G, Detsky AS. Does this adult patient with suspected bacteremia require blood cultures? JAMA 2012;308:502–11.

Správný odběr a jeho načasování Molekulární diagnostika septických stavů Správný odběr a jeho načasování Schéma Počet odběrů Doba odběrů I 1. vzestup tělesné teploty 2. hodina po prvním 3. hodina před vrcholem teplotní křivky II v rozmezí 1 hodiny před začátkem terapie těsně před podáním ATB III akutní sepse dvě hemokultury současně před začátkem ATB terapie IV endokarditida dvě hemokultury současně před začátkem ATB terapie pie 3 hodiny po prvních odběrech V pac. neg. inic. hemok. 3 dodatečné hemokultury 2. a 3. den v době nejnižší hladiny ATB Molukulární diagnostické metody by měly kopiírovat mikrobiologická schémata odběru vzorků Všechny schémata vyžadují vícenásobné odběry v přesně definovaném čase To se v molekulární diagnostice většinou neděje a to ani v publikovaných studiích Což je jeden ze zdrojů z deziluze

Sensitivita Molekulární diagnostika septických stavů 1 bakterie/10 ml Úroveň bakerinémie Dospělí 10-80 baktérií / ml Děti >100 baktérií / ml 1 bakterie/10 ml 0,1 bakterie/1 ml 100 bakterií/1 ml Kruciální je správné načasování odběru Zakoncentrovánní vzorku Zaměření se na multikopiové cílové sekvence 1000x 1 bakterie/10 ul

Sensitivita a spolehlivost Molekulární diagnostika septických stavů Sensitivita a spolehlivost Kultivační metody Citlivější - až 1000x citlivější ve srovnání s PCR Nižší spolehlivost - závislost na viabilitě, ATB terapii, nutričních nárocích, délce životního cyklu Kultivačně nezávislé metody Nízká analytická sensitivita - 100 baktérií / ml Vysoká spolehlivost nad úrovní analytické citlivosti Obě metody se ve svých limitech úžasně doplňují Experimentálně prokázáno na králičím modelu 10E8 – 100%, když >10CFU, 79% když <CFU, Dna přetrvávala delší dobu, když hemokultury byly již negativní

Zvýšení sensitivity PCR metod Molekulární diagnostika septických stavů Zvýšení sensitivity PCR metod Zakoncentrování vzorku během izolace NK Zvyšování iniciačního objemu a snižováním objemu elučního Selektivní izolace mikrobiální DNA (MolYsis™) Když pomineme metodiku správné indikace a správného odběru existují v zásadě 2 přístupy na zvýšení sensitivity PCR metody

Zvýšení sensitivity PCR metod Molekulární diagnostika septických stavů Zvýšení sensitivity PCR metod Zvýšení vkladu vzorku do PCR reakce Zacílení do multikopiových sekvencí Fungal ribosomal rDNA complex 5´ETS-18S rRNA-ITS1-5,8S rRNA-ITS2-28S rRNA- 3´ETS 40-80 repetitivních sekvencí na haploidní genom 0,15 buňky/PCR = 6 kopií/PCR = 3 buňky/ml detekce ribosomální RNA 7000 – 70 000 ribosómů / buňku Marker rozlišení mrtvých organismů od aktivní infekce Když pomineme metodiku správné indikace a správného odběru existují v zásadě 2 přístupy na zvýšení sensitivity PCR metody Dendis M, Horvath R, Michalek J, et al. PCR-RFLP detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia. Clin Microbiol Infect 2003; 9:1191–202.

Falešně pozitivní výsledky Molekulární diagnostika septických stavů Falešně pozitivní výsledky Nukleové kyseliny baktérií a hub nás doslova obklopují Pro průkaz nukleových kyselin neplatí mikrobiologická pravidla sterility Autoklavování – omyl většiny prodejců při argumentaci o sterilitě

Falešně pozitivní výsledky Molekulární diagnostika septických stavů Falešně pozitivní výsledky z důvodu detekce „mrtvých“ pathogenů v organismu   Doba eliminace Živé buňky 5 minut DNA z plné krve 15 minut DNA ze séra 150 minut Mrtvé mikroorganismy a jejich DNA jsou z krevního oběhu velmi rychle eliminovány Sérum a plasma můžou být vhodnějším materiálem pro detekci mikroorganismů z krve Mýtus New Zealand rabbits 10E5 CFU CALB 10E8 100% záchyt >10CFU/ml, 79% <10CFU/ml Bougnoux, M., C. Dupont, J. Mateo, P. Saulnier, V. Faivre, D. Payen, and M. Nicolas-Chanoine. 1999. Serum is more suitable than whole blood for diagnosis of systemic candidiasis by nested PCR. J. Clin. Microbiol. 37:925–930

Falešně pozitivní výsledky Molekulární diagnostika septických stavů Falešně pozitivní výsledky Exogenní kontaminace Nutno zajistit DNA sterilitu celého diagnostického procesu od odběrovek po výsledek a důsledné používání negativních kontrol Interpretace pozitivního výsledku především neobvyklých nálezů musí být interpretována v kontextu možné exogenní kontaminace Mýtus New Zealand rabbits 10E5 CFU CALB

Metody průkazu NK pathogenů Molekulární diagnostika septických stavů Metody průkazu NK pathogenů PCR Univerzální detekce Multiplex Nejednotnost metod používaných k průkazu Omezený počet patogenů Méně náchylné na kontaminaci Rychlejší a jednodušší Univerzální detekce Náchylnost na kontaminaci Delší a náročnější

Úskalí interpretace výsledků Molekulární diagnostika septických stavů Úskalí interpretace výsledků Z jednoho vzorku můžeme získat dva diametrálně rozdílné výsledky, přičemž oba jsou správně Primární detekce mikroorganismů, které rostou snáze 23 pozitivních záchytů, 19 shoda, 4 diskrepance Strptococcus versus atypická mykobakterie - nejkřiklavější Primární detekce mikroorganismů, kterých je ve vzorku více J. Gallo, M. Kolar, M. Dendis et al., “Culture and PCR analysis of joint fluid in the diagnosis of prosthetic joint infection,” New Microbiologica, vol. 31, no. 1, pp. 97–104, 2008.

Úskalí interpretace výsledků Molekulární diagnostika septických stavů Úskalí interpretace výsledků Detekce nekultivovatelných a „obskurních“ mikroorganismů V roce 2000 – dle RFLP nejdříve jako Streptococcus – pacient byl přeléčen vypuštěn domů O rok později sekvenováním TW Jak by postupovali lékaři? Od lekařů častá otázka na sdělení PCR pozitivního výsledkyu: A co máme dělat? Tropheryma whipplei Grijalva M, Horváth R, Dendis M, Cerny J, Benedík J. Molecular diagnosis of culture negative infective endocarditis: clinical validation in a group of surgically treated patients. Heart 2003;89:263–268

Molekulární diagnostika septických stavů Molekulární diagnostika není lepší nebo horší než jiné diagnostické metody Je pouze kolečkem v soukolí komplexního diagnostického procesu na jehož konci je vyléčený pacient

Děkuji za pozornost!