PCR

Polymerase chain reaction PCR

Je technika, která umožňuje v krátkém času namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé množství nebo je DNA znečištěna za několik hodin je schopna metoda PCR vyprodukovat kolem miliardy kopií DNA

PCR Metoda PCR se sestává ze tří kroků, při kterých se množství DNA zvětšuje exponenciálně klíčovým enzymem je DNA-polymeráza z Thermus aquaticus, žijícím v horkých pramenech Yellowstonského národního parku tato polymeráza nese název Taq polymeráza, je odolná vůči vysokým teplotám a zůstává aktivní přes mnoho cyklů

PCR Krom vysoké rychlosti je na metodě PCR impozantní její selektivita. Známe-li příslušné sekvence, PCR je schopna „vybrat“ z dlouhé molekuly DNA oblast, která má být namnožena, například konkrétní gen objevil Kally Muris O 10 let později obdržel Nobelovu cenu. Metoda se dnes běžně užívá v mnoha laboratořích

PCR Příklady úspěšného užití: namnožení DNA z let starého srstnatého mamuta namnožení mtDNA neandrtálce namnožení nepatrného množství DNA z dějiště zločinu. Stačí malé množství krve, tkáně či spermatu namnožení DNA z jednotlivých embryonálních buněk v rámci prenatální diagnostiky namnožení virové DNA z buněk, ve kterých se dá jinak jen těžko prokázat přítomnost viru, jako je HIV

PCR Potřeby: DNA, která má být namnožena Taq polymeráza zásoba primerů, ohraničujících cílovou sekvenci. zásoba dATP, dCTP, dGTP, dTTP MgCl 2

PCR Prvním krokem je krátké zahřátí celé směsi na 94 o C -96 o C. Teplem se poruší vodíkové vazby a oba řetězce DNA se oddělí

PCR Druhým krokem je ochlazení směsi na 50 o C - 65 o C. Ochlazení umožní primerům se navázat na cílovou DNA vodíkovými můstky podle pravidel komplementarity

PCR Primery jsou krátké, synteticky vyrobené molekuly jednořetězcové DNA (20-30 nukleotidů), které jsou komplementární ke koncům DNA, která má být amplifikována. Primery tak determinují místo na DNA, které má být zmnoženo (na obrázku označeno modře)

PCR Třetí krok: DNA-polymeráza nyní může přidávat nukleotidy k 3´koncům primerů, jako při obvyklé replikaci Směs je zahřáta na 72 o C

PCR Směs je nyní znovu ohřáta a začíná nové kolo cyklu každé kolo trvá pouze asi 5 minut. Výsledkem je dvojnásobné množství cílové DNA, dlouhé i stovky párů bází tento tříkrokový cyklus je následně opakován znovu a znovu. Za třicet cyklů je možno teoreticky obdržet miliardu kopií

PCR

Gelová elektroforéza Gelová elektroforéza je metoda, která odděluje jednotlivé fragmenty DNA na základě jejich pohybu gelem. Pohyb je způsoben elektrickým polem směr a rychlost pohybu je dán nábojem molekul, jejich velikostí a tvarem a rovněž velikostí náboje elektrického pole a složením gelu DNA je nabitá záporně, bude se tedy pohybovat ke kladnému konci

Restrikční endonukleázy EcoR1

Gelová elektroforéza