ZPRACOVÁNÍ TKÁNĚ PRO HISTOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ MUDr. Filip Wagner Ústav histologie a embryologie Lékařská fakulta UP v Olomouci

ODBĚR MATERIÁLU Biopsie (materiál odebíraný od živé osoby) (např. excize, punkce, kyretáž) Nekropsie (materiál odebíraný po smrti při pitvě) velikost vzorku do velikosti 1 × 1 × 0,5 cm v případě potřeby opláchnutí ve fyziologickém roztoku k odstranění krve vložení do fixačního roztoku pečlivé označení vzorku (zábrana záměny)

MOŽNOSTI ZPRACOVÁNÍ zpracování tkáně na zmrzlo „zalití tkáně do parafinu nebo jiného média“

POSTUP PRO „ZALITÍ DO PARAFINU“ fixace tkáně „blokování nebo přikrajování tkáně“ odvodnění tkáně (alkohol) projasnění tkáně (xylen) prosycení tkáně parafinem zalití do parafinu krájení bloků a natažení na podložní sklo prosycení parafinem fixace odvodnění projasnění zpravidla formol alkohol ve vzestupné koncentraci xylen parafin

FIXACE I Je rychlé vysrážení (denaturace) bílkovin protoplasmy buněk a tkání fixačními prostředky Účelem je zabránit samovolnému rozkladu tkání (autolýze) !!! Uložení tkáně ve fyziologickém roztoku nebo v lednici autolýze NEZABRÁNÍ !!!

FIXACE II Fixační prostředky musí: Denaturace musí být rychlá a šetrná zachovat co nejlépe strukturu pronikat dobře do tkáně zachovat barvitelnost tkáně Denaturace musí být rychlá a šetrná Fixační prostředky jsou fyzikální a chemické

FYZIKÁLNÍ FIXACE Využívá tepla nebo vysušení za nízké teploty Fixace varem (nedokonalá a vede k hrubému porušení tkáně) Fixace vysušením za nízké teploty se někdy využívá při histologickém průkazu citlivých látek (např. enzymy)

CHEMICKÁ FIXACE Využívají se roztoky označované jako fixační tekutiny (ev. směsi) 10% neutrální formol Zenkerova tekutina Bouinova tekutina Metacarn … (další podle potřeby)

10% neutrální formol využívá se 10% roztoku formolu (tedy 4% roztok formaldehydu) k neutralizaci roztoku od kyseliny mravenčí se používá uhličitan vápenatý Bakerova tekutina voda pramenitá 225 ml chlorid vápenatý 1,0 g formol neutrální 25 ml neutrální nárazníkový formol neutrální formol 100 ml voda pramenitá 900 ml dihydrogenfosforečnan sodný 4 g hydrogenfosforečnan sodný (bezvodý) 6,5 g brómformol neutrální formol 150 ml bromid amonný 20,0 g destilovaná voda 850 ml

Bouinova tekutina je žluté barvy proniká rychle, tkáň se po fixaci barví nasycený roztok kyseliny pikrové 3 díly formol 1 díl Před upotřebením: přidat na každých 100 ml roztoku 5 ml kyseliny octové

Zenkerova tekutina oranžová barva doba fixace 24 hodin po fixaci nutno vypírat 24 hodin v tekoucí vodě sublimát 5,0 g dichroman draselný 1,0 g síran sodný 2,5 g destilovaná voda 100 g před použitím: přidat na každých 100 ml roztoku 5 ml kyseliny octové

Metacarn

Blokování a přikrajování odebrané tkáně v průběhu nekropsie nebo biopsie (zejména větších kusů tkání odebraných v průběhu operací) je třeba následně zpracovat tkáň přichází na histologické pracoviště ve fixační tekutině a je třeba z tkáně připravit takový vzorek, který bude mít adekvátní velikost, bude z místa, které je nutné vyšetřit, a bude dostatečně reprezentativní (např. při pitvě se odebere ze srdce celý Šiklův řez, kdy na přední stěně levé komory (LK) bude makroskopicky patrné infarktové ložisko – není možné zpracovat celý Šiklův řez srdce, ale je třeba z něho odebrat vzorky, takže se vytvoří vzorek (blok) z přední stěny LK z místa zastiženého infarktu, ze zadní stěny LK, z laterální stěny LK, z mezikomorového septa a z pravé komory) v případě, že při histologickém vyšetření není v daném preparátu (bloku) zastižená tkáň dostatečně reprezentativní, je možné z fixované tkáně „doblokovat“ – přikrojit další vzorek (samozřejmě jen v případě, že je taková tkáň k dispozici) fixované tkáně se ukládají jako tzv. rezervy do doby stanovení diagnózy

Histologické pracoviště

skříně pro uložení rezerv

DALŠÍ ZPRACOVÁNÍ TKÁNÍ odvodnění tkáně provádíme alkoholem ve vzestupné koncentraci alkohol (60%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%) následně promořujeme ve třech lázních xylenu (postup se označuje jako projasnění) tkáň prosytíme v rozpuštěném parafinu jehož teplota nesmí přesáhnout 58oC Vysvětlení: Podstatnou část hmotnosti a objemu tkáně tvoří voda (obecně u dospělého asi 60 %, u dětí až 80 %), voda a parafin jsou látky vzájemně nemísitelné, protože chceme ve výsledku tkáň prosytit parafinem, je nezbytné vodu odstranit. Nejběžněji dostupnou látkou je alkohol, kterým postupně ve vzestupné koncentraci tkáň odvodníme. Protože ani alkohol není rozpouštědlem pro parafin, je třeba i alkohol z tkáně odstranit látkou, která by byla schopna napomoci prosycení tkáně parafinem – k tomu se používá xylen, kterým alkohol odstraníme. Následně je již možné tkáň prosytit rozpuštěným parafinem. Mezistupeň v podobě odvodnění alkoholem není možné vynechat! Xylen je s vodou vzájemně nemísitelný a nemůže tedy sloužit k odvodnění.

ODVODNĚNÍ ŘEZŮ

odvodňovací automat

XYLEN

PROSYCENÍ PARAFINEM I

PROSYCENÍ PARAFINEM II

ZALÉVÁNÍ I tkáň prosycená parafínem se zalévá do forem nebo krabiček rozpuštěným parafínem tkáň je třeba vhodně orientovat vždy je třeba mít na paměti pečlivé označení tkáně k odstranění vzduchových bublin parafín okolo tkáně protáhneme zahřátou jehlou k zalévání slouží

ZALÉVÁNÍ II

ZALÉVÁNÍ III

Zalévání do parafínu

TKÁŇOVÉ BLOČKY skříně pro archivaci parafinových bločků Tkáňové bločky na dřevě pro uchycení v mikrotomu (dnes se už nepoužívá) skříně pro archivaci parafinových bločků

KRÁJENÍ I ke krájení parafinových bločků se používají „mikrotomy“ rozlišují se sáňové a rotační mikrotomy (podle způsobu ovládání) některé mikrotomy mohou být poloautomatické (elektronické řízení tloušťky, automatického provedení určitého počtu řezů …) tloušťka řezu se upravuje podle tkáně, která se krájí (např. podle její tvrdosti), běžně se používá tloušťka okolo 5 µm

KRÁJENÍ II

KRÁJENÍ III

NATAHOVÁNÍ PREPARÁTŮ preparáty nakrájené na mikrotomech se umísťují na podložní skla k dalšímu zpracování na podložní sklo umístěné na speciální zahřívací plotně se kápne voda a do ní se umístí preparát (z parafinového bloku ukrojená tkáň), který se natáhne a po odpaření vody přilne na sklo --- nebo se přenese preparát do vodní lázně, kde se roztáhne a následně se zanořením podložního skla a jeho vyzvednutím s preparátem na toto sklo natáhne a přilne v současnosti se používá speciálních podložních skel, dříve se musela skla potírat glycerol-bílkem, aby na nich tkáně držely

ZALÉVÁNÍ DO JINÝCH MÉDIÍ zalévání do celoidinu zalévání do celoidin – parafinu zalévání do médií rozpustných ve vodě zalévání do želatiny zalévání do celodalu zalévání do vosků rozpustných ve vodě

ZPRACOVÁNÍ TKÁNĚ „NA ZMRZLO“ používá se zpravidla „čerstvých“ tkání (je možné zpracovávat i tkáně fixované) ke krájení tkání se používá kryostat, kdy se tkáň zmrazí a následně se zmražená krájí (kryostat je vlastně speciálně upravený mikrotom, aby bylo možné pracovat v hlubokém mrazu) vyšetření tkáně „na zmrzlo“ se používá v případě, kdy je třeba rychle výsledek vyšetření (např. peroperační biopsie), nebo v případech, kdy je třeba tkáň zpracovat šetrně, aby nedošlo k porušení její struktury (chemické stavby) použitím postupů a chemikálií, které se používají při zalití do parafinu nebo jiných médií