Histologická technika Princip barvení, druhy barviv. Základní a speciální barvicí metody. Identifikace barvicích metod na preparátech. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 8.10.2012

Barvení Neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury, mají stejný index lomu (prohlížení jen s použitím speciálních optických zařízení – mikroskop s fázovým kontrastem) Běžná světelná mikroskopie - založena na použití velké palety barvicích metod Barviva jsou látky, které absorbují světlo určitých vlnových délek. To, co pak vnímáme jako barevný vjem, jsou neabsorbované vlnové délky. Různé součásti buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit Barvení nefixovaných tkání: Vitální: např. tuš, trypanová modř, lithiumkarmín, aplikace do krve či vaziva – vychytávání se sleduje na řezech. Fagocytární aktivita buněk. Supravitální: např. Janusova zeleň – mitochondrie, methylenová modř – nervové bb.

Histologická barviva Zásaditá (bazická), také jádrová, barví bazofilní struktury (jaderný chromatin, ribosomy), př.: hematoxylin, methylenová modř, toluidinová modř, thionin Kyselá (acidická), také plasmatická, barví acidofilní struktury (cytoplasma, kolagenní vlákna), př.: eosin, světlá zeleň, anilinová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin Bazofilie je vlastnost struktur barvit se bazickými barvivy. Acidofilie (eosinofilie, oxyfilie) je vlastnost struktur barvit se kyselými barvivy. Barviva podle původu: Přírodní: hematoxylin, karmín, orcein, šafrán Syntetická Aby bylo dosaženo standardní kvality, jsou dnes i přírodní barviva většinou připravována uměle.

Barvení Barvení podle způsobu aplikace: Progresivní – tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení, pak se proces přeruší Regresivní – tkáň se přebarví, přebytečné barvivo se z tkáně odstraní příslušným roztokem pod kontrolou zraku (diferenciace) Sukcedánní – barvení řezu postupně v několika barvicích roztocích Simultánní – barvení řezu roztokem různých barviv současně In toto – barvení celého bloku tkáně Barvení podle výsledků barvení: Ortochromatické – složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivo Metachromatické – jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě barevných tónech (např. při průkazu hlenu v buňkách produkujících hlen barvíme toluidinovou modří – hlen je ale červenofialový), metachromatická barviva jsou např.: toluidinová modř, thionin, methylenová modř Difúzní – barvicí roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě Elektivní – barvicí roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá

Přehledné barvicí metody Obarví jádra a cytoplasmu rozdílným barevným tónem a zároveň obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně. Používá se jádrové a jedno nebo více kyselých barviv (použití více kyselých barviv umožní barevné rozlišení vaziva a svaloviny). 1. Hematoxylin – eosin Základní barvicí metoda barvení parafínových řezů 2. Massonovy trichromy Podle zbarvení vaziva: a) žlutý b) zelený c) modrý 3. Weigert van Gieson 4. AZAN

Příprava hematoxylinu Hematoxylin je nažloutlý krystalický prášek – jeho roztok sám o sobě nebarví. Nutná je oxidace v hematein (samovolně na vzduchu zraje měsíce, urychluje se přidáním oxidačních činidel – jodičnan sodný). Hematein má slabou afinitu ke tkáním, musí se použít mořidlo (soli Al, Fe) Barví barevný lak hemateinu Podle mořidla se rozeznávají různé druhy hematoxylinů: Kamencové hematoxyliny (Harrisův, Mayerův): např. HE, žlutý trichrom, dobarvení jader u speciálních metod Železité hematoxyliny Weigertův: zelený a modrý trichrom, Weigert van Gieson, Heidenhainův hematoxylin

Barvení hematoxylinem a eosinem, HE 1. Odparafínování, deparafinace Xylen ve 2 lázních po 5´, alkohol v sestupné řadě (100%, 96%), voda 2. Barvení Hematoxylin 3-10´, voda, regresivní barvení, diferencování v kyselém alkoholu (70% alkohol s HCl), voda Eosin 0,1-0,5% roztok 1-3´, voda, diferencování v 80% alkoholu 3. Odvodnění Dvě lázně alkoholu 96%, fenolxylen 20-25%, 3´ 4. Projasnění 2 lázně xylenu po 5 min. 5. Zamontování Zamontování do montovacího média, sušení

Montovací média Požadavky: bezbarvé, vysoký index lomu, nesmí odbarvovat, musí mít konzervační účinek rozpustná ve vodě: glycerin, glycerínová želatina nerozpustná ve vodě: kanadský balzám, epoxidová pryskyřice - Entelan Pomocí montovacího média obarvený řez zamontujeme pod krycí sklo.

Hematoxylin-eosin (HE) jádra vazivo sval Hematoxylin barví bazofilní součásti buňky- jádro, ribosomy, GER Eosin barví acidofilní struktury buňky – hlavně proteiny (cytoplasma, mitochondrie, hladké ER) Výsledek barvení: jádra – modrá, modročerná, cytoplasma růžová, svalovina červená, kolagenní vlákna růžová

HE, močový měchýř svalovina epitel vazivo vazivo cévy sval

Massonovy trichromy Žlutý Massonův trichrom (ŽT): Barviva: Harrisův hematoxylin, eosin, šafrán Výsledek barvení: jádra tmavě modrá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna žlutá, svalovina červená, erytrocyty červené Modrý Massonův trichrom (MT): Barviva: hematoxylin (Weigertův), kyselý fuchsin-ponceau, anilínová modř Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna modrá, svalovina červená Zelený Massonův trichrom (ZT): Barviva: hematoxylin (Weigertův), ponceau–kyselý fuchsin–světlá zeleň, oranž G Výsledek barvení: jádra tmavě hnědá, cytoplasma okrová, kolagenní vlákna zelená, svalovina červená, erytrocyty oranžové

Massonův žlutý trichrom, jícen epitel kolag. vazivo svalovina žlázky Kolagenní vlákna se barví žlutě. Mikrofotografie: prof. Martínek

Massonův modrý trichrom, fundus žaludku epitel svalovina kolag. vazivo Kolagenní vlákna se barví modře. céva

Massonův zelený trichrom, larynx svalovina epitel kolag. vazivo Kolagenní vlákna se barví zeleně. žlázky

Weigert van Gieson Hrot jazyka Dřeň ledviny vazivo svalovina Foto: doc. Z. Jirsová Dřeň ledviny Barviva: Weigertův železitý hematoxylin, pikrofuchsin Výsledek bavení: jádra hnědočerně, fuchsin barví kolagenní vlákna červeně, kyselina pikrová cytoplasmu, svalovinu a erytrocyty žlutě Mikrofotografie: Kühnel, Pocket Atlas, 2003

AZAN, slinná žláza Barviva: azokarmín, anilínová modř, oranž G vazivo jádra Barviva: azokarmín, anilínová modř, oranž G Výsledek barvení: Jádra karmínově červená, cytoplasma světle fialová, kolagenní vlákna blankytně modrá, svalovina červená, erytrocyty oranžovočervené

AZAN svalovina jádra kolag. vazivo

Speciální barvicí metody - příklady Cílené metody, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či tkáňový detail Cytologické metody: Heidenhainovo barvení Barvení elastických vláken (elastinu): orcein, aldehyd-fuchsin, resorcin-fuchsin Průkaz retikulárních vláken: impregnace stříbrem, PAS reakce Histochemické metody Neurohistologické metody: Barevné: průkaz Nisslovy substance (Nisslova metoda) Průkaz myelinu: Weigertova metoda, luxolová modř Impregnační: Znázornění neurofibril Znázornění gliových buněk

Heidenhainův železitý hematoxylin, HH Mitochondrie, HH Kosterní sval, HH

Barvení na elastiku, artérie Membrana elastica interna Elastická vlákna v medii Membr. elastica externa

Retikulární vlákna, impregnace, játra Trámce hepatocytů Portobiliární prostor Retikulární vlákna