Imunologické, mikrosatelity, SSCP, SINE Další techniky Imunologické, mikrosatelity, SSCP, SINE

Obsah imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky

Obsah imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky

Imunologické techniky stanovení imunologických distancí sdílení jednotlivých znaků (antigenů)

Stanovení imunologických distancí precipitace (turbidometrie či imunodifuse) komplement fixační reakce aglutinace ELISA Ria

Imunodifuse

Dvojitá imunodifuse

Imunoelektroforéza

Hemaglutinační test

ELISA

Využití imunologických technik kvalitní distanční data multilokusová (totilokusová) metoda metodicky relativně nenáročné umožňuje porovnávat i velmi vzdálené taxony

Úskalí imunologických technik U-závislost precipitace na koncentraci antigenu krosreaktivita závisí nejen na podobnosti epitopů ale i na jejich koncentraci nutnost přípravy polyklonálních protilátek

Obsah imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky

Mikrosatelity mikrosatelity - (nazývané i STR - Short Tandem Repeat) jsou krátké sekvenční motivy (dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se na některých místech genomu v mnoha tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce až 150 nukleotidů. Zpravidla existuje velmi značný vnitropopulační polymorfismus v počtech kopií daného mikrosatelitu a tento polymorfismus a mutabilitu (okolo 0,1 % mutací za generaci) můžeme snadno studovat například PCR amplifikací daného lokusu.

Analýza mikrosatelitů najít vhodný lokus (klonování a hybridizace) připravit PCR primery ohraničující daný lokus amplifikovat lokus elekroforéza amplifikovaných fragmentů

Mikrosatelity Analýza jednolokusového polymorfismu pomocí ptačích mikrosatelitních primerů.

Využití metody vnitrodruhové studie či příbuzné druhy kodominance znaků – populační genetika modernější a přesnější varianta alozymové analýzy možno analyzovat velké množství vzorků nákladné pouze zavedení metody pro nové organismy

DNA-fingerprinting- minisatelity Restriktáza-fingerprint ptačí DNA. Genová DNA byla štěpena restrikčním enzymem, přeblotována na nylonovou membránu a hybridizována s radioaktivně značenou sondou 33.15

VNTR VNTR polymorfismus v promotoru RHOB genu u člověka: 8-11 x 34 bp (amplifikováno pomocí PCR)

Obsah imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky

SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) - metoda identifikace polymorfismu v sekvencích DNA a RNA umožňující na molekulách v jednořetězcovém stavu (u DNA po denaturaci) detegovat pomocí polyakrylamidové elektroforézy rozdíly v elektromobilitě vyvolané jednotlivými substitučními mutacemi.

PCR denaturace renaturace vertikální elektroforéza vizualizace _ _ _ + + + _ _ _ vizualizace

SSCP HLA polymorfismus sledovaný pomocí SSCP. Jednořetězcové fragmenty byly připraveny pomocí asymetrické PCR.

Využití metody obdoba sekvenčních dat umožňuje velmi rychle a velmi levně charakterizovat velké množství vzorků množství získané informace je srovnatelné se sekvenováním neboť většina mutací se projeví změnou pohyblivosti příslušného fragmentu (alespoň jednoho řetězce) je vhodné charakterizovat jednotlivé varianty sekvenací

Obsah imunologické techniky Mikrosatelity a techniky příbuzné SSCP unikátní znaky

SINE analýza (short interspersed repetitive elements) – retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL RNA (Alu). Velikost: 70-500 PB. Vytvářejí značnou část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na genom. Výhoda pro molekulární fylogenetiku existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného místa vystřihly.

Postup Najít nový SINE element (in vitro transkribce celkové DNA) Naklonovat úseky genomu obsahující daný SINE (genomová knihovna) Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u studovaného taxonu (hybridizace nebo PCR) PCR amplifikace Ověření absenci SINE sekvenací získaných krátkých PCR fragmentů

Výsledek SINE analýzy (cichlidy) PCR produkty EtBr Hybridizace se SINE probou Hybridizace s okolní sekvencí Takahashi, Tera, Nishida, Okada (1998) Mol.Biol.Evol. 15: 391-407.

Fylogeneze kopytníků a kytovců na podkladě SINE insercí

Využití SINE analýzy použitelná pro vyšší taxony (maximálně však 75-100 milionů let málo znaků – není možno počítat délku větví unikátní události malá pravděpodobnost homoplázií vždy nutno ověřit absenci SINE v daném lokusu minimálně amplifikací, raději sekvenací