PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce

Outline Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymeráza Princip procesu PCR Optimalizace PCR Typy PCR Aplikace PCR a využití v praxi

Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dGMP) http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html

“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“ Cytosine Guanine From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html

Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5’ end 3’ end konce dsDNA nejsou stejné jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena OH HO T A 5 4 1 3 2 G C T A G C 3’ end 5’ end

Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle iontové síle pH délce DNA Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49

DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primáza helikáza DNA polymeráza DNA ligáza SSB-proteiny http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html

Vlastnosti DNA polymerázy 1. POLYMERÁZOVÁ AKTIVITA Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec. 2. 3'-5' exonukleázová aktivita -opravná funkce “proofreading” 3. 5´exonukleázová aktivita - odštěpuje RNA primer

DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymeráza 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerázy - DNA polymerase I in vitro polymeráza vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsDNA templát primer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ Forward primer dNTPs 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG DNA POL 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’

Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’ 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG DNA POL 3’ 5’ dNTPs Reverse primer 5’ 3’ GCATATACTCGATTTCT 5’ 3’ TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3’ 5’

PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce

Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty potřeba silného enzymu (polymerázy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách Polymeráza izolovaná z termofilní bacterie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymeráza

PCR komponenty Templátová DNA Primery dATP, dTTP, dCTP, dGTP vzorek k amplifikaci Primery krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace dATP, dTTP, dCTP, dGTP volné stavební jednotky DNA Thermostabilní DNA polymeráza (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)

Proces PCR Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu Proces

Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace Polymeráza pracuje i při nízských teplotách (e.g., během nastavování reakce) “Hot start” PCR je řešení Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu “Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici: …gacgt, …gacga, …gacgg, …gacgc) “Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí

Navrhování primerů Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery

Příklad navržení primerů: Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’ Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’ Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’

Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko

Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL složení: Templátová DNA 1-1000ng Primery 10 -20 pmols 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl MgCl2 0.5 -3.0 mM 50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2 jednotky Taq polymerázy

Praktické provedení PCR Počáteční denaturace 94oC 3-5 min denaturace 94oC 30 sec annealing ~55oC 30 sec prodlužování 72oC 1min/kilobáze počet cyklů 25-35 x

Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza

PCR Optimalizace Složka MgCl2 KCl Enzym, Primer pH nespecificky Nízká specificita Vysoká specificita AnnealingTeplota - Tm MgCl2 KCl Enzym, Primer pH nespecificky Formamid Nespecifická amplifikace

RT PCR (reverse transcriptase PCR) Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dT random hexamer primer hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů

RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA

asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR jednozkumavková reakce PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře fluorometr s automatickým vyhodnocením

multiplex PCR nested PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR

long PCR amplifikace dlouhých úseků, polymerázové kokteily – např. Klenowův fragment + Pfu polymeráza Pwo polymeráza z Pyroccocus woesei

in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů

real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etBr) fluorometr je součástí termocykleru

Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce virových a bakteriálních onemocnění

Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) AS PCR alelicky specifická PCR primer navžen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmety DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT

Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. EVOLUČNÍ BIOLOGIE ORNITOLOGIE skot ovce prase koza TEST