Reakční kinetika enzymových reakcí; regulace činnosti enzymů

Reakční kinetika enzymových reakcí   invertasa sacharosa + H2O  glukosa + fruktosa hexosafosfátisomerasa D-glukosa-6-fosfát  D-fruktosa-6-fosfát

Reakční kinetika enzymových reakcí Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S  P. k1 = 0,01 s-1, k-1 = 0 s-1 pro případ 1 ("nevratná reakce") k1 = 0,006 s-1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)

Reakční kinetika enzymových reakcí monomolekulární přeměna S  P Základní definice: pro náš případ: = - Základní model: k1 k2 E + S ES(EP) P + E k -1 k -2   Zanedbat zpětnou reakci? k1 k2 E + S ES  P + E k-1

schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času Další důležité pojmy:   definice limitní rychlosti: Vlim = k2 . [Eo] = číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu Katalytická aktivita enzymového preparátu ( množství aktivního enzymu) K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku) - kolik potřebuji enzymu pro reakci - koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za definovaných podmínek (pH, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol (1 mol) substrátu za 1 sec (1 min). když [E0] = [ES] počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturaci substrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času

Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu

Reakční kinetika enzymových reakcí

Reakční kinetika enzymových reakcí Jak určit hodnoty KM a Vlim? metoda počátečních reakčních rychlostí: závislost vo na [S] Metoda nelineární regrese: Odhad KM = 1,8 mmol.dm-3 a Vlim = 2,5 mmol.dm-3.min-1 "Správné" hodnoty: KM = 2,04  0,43 mmol.dm-3, Vlim = 2,04  0,16 mmol.dm-3.min-1 Michaelisovská závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu.

Závislost počáteční reakční rychlosti na pH a teplotě

VÍCESUBSTRÁTOVÁ KINETIKA - následný mechanismus (postupný, sekvenční) - náhodný - uspořádaný   - "ping-pongový" E-P + S1  E-P* + P1 E-P* + S2  E-P + P S1 + S2  P1 + P2

"ping-pongový„ mechanismus

"NEMICHAELISOVSKÉ" ENZYMY - positivní homotropní allosterický efekt (allosterické enzymy) - heterotropní allosterický efekt

Alosterické enzymy

Regulace enzymové aktivity

Regulace enzymové aktivity na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní) pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými enzymy) - nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy) - vratné (fosforylace, adenylace...) efektory (aktivátory a inhibitory)

Regulace enzymové aktivity INHIBICE: - nevratná vratná: a) substrátem b) kompetitivní (competitive) c) akompetitivní (acompetitive) d) nekompetitivní (noncompetitive)

Kompetitivní inhibice KM´ = , V´lim = Vlim

Kompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice

Akompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice V´lim =

Nekompetitivní inhibice

Regulace enzymové aktivity

Allosterická inhibice (aktivace)

Příklad Odhadněte hodnoty Km a Vlim. Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí koncentrace substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce: Odhadněte hodnoty Km a Vlim. Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu 2,5 . 10 –5 a 5 . 10-5 mol/dm3 ?

Imobilizované enzymy Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně

Biotechnologie Definice? Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě. Přednosti: surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí Nevýhody: Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?

Biotechnologické směry Průmyslová mikrobiologie Fermentační (ethanol, kyselina citronová) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery), Biotransformace Biomasa Průmyslové biotechnologie Biotechnologie životního prostředí (bioremediace) Živočišné biotechnologie Biotechnologie užitkových rostlin Veterinární a medicínské biotechnologie

Využití enzymů → aplikovaná enzymologie využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk: průmysl potravinářský a nepotravinářský klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů) farmaceutika Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) – 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12% !) Oxidoreduktasy – (GOD - analytika) Ostatní (5 - 7%) Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO rekombinantní technologie živočišné a rostlinné

Příklady Biodetergenty (proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy) Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy) Mlékárenství (chymosin) Hydrolýza proteinů ……. až po „biostoning“ (celulasy)