Seminář o projektu AescuLab

v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu Název projektu: AescuLab – systematické laboratorní vzdělávání studentů a pracovníků VaV v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu Doba řešení: 1.9.2009 – 31.8.2012 vypracování 100 laboratorních postupů vytvoření 100 videosekvencí uspořádání 300 workshopů Cíl projektu:

Molekulární a buněčné biologie Imunologie Laboratorní metody z oblasti Biochemie Molekulární a buněčné biologie

Laboratorní metody z oblasti imunologie GMO Manipulace s laboratorními zvířaty ELISA analýza specifické protilátkové odpovědi experimentálních zvířat Inhibiční ELISA Stanovení specifických protilátek ve vaginálním sekretu myší Analýza antigen specifické odpovědi T lymfocytů a jejich subpopulací pomocí ELISPOT Analýza antigen specifické odpovědi T lymfocytů a jejich subpopulací pomocí Flow Cytometry Test proliferační odpovědi subpopulací T lymfocytů po stimulaci antigenem Indukce tvorby cystických forem B. burgdorferi za různých kultivačních podmínek Analýza životnosti kvasinek pomocí Flow Cytometry Indukce morfologických změn Candida albicant Metody odstranění a průkazu endotoxinů (LPS) Analýza subpopulací splenocytů pomocí Flow Cytometry Analýza N-glykosylace gp120 proteinu pomocí lektinových blotů Analýza N-glykosylace gp120 proteinu pomocí štěpení endoglykasydasami Analýza sialyltransferasové aktivity Golgiho extraktu bb. populace

Laboratorní metody z oblasti imunologie Sledování dělení vybrané buněčné populace pomocí CFSE Transfekce tkáňových kultur savčích bb. linií liposomy, polyaminy Příprava cDNA - reverzní transkripce Izolace totRNA z vláknitých hub Chomczynki, lithium extrakce Separace vybrané buněčné populace pomocí magnetických partikulí; izolace mRNA - magnetické partikule, kolonky Návrh primerů pro nested PCR a testování podmínek Kvantitativní PCR s použitím duálně BHQ1-FAM prób PCR klonování, izolace PCR produktu pro PCR klonování Klonování s použitím restrikčních enzymů a DNA ligasy, restrikční analýza Příprava rekombinantních proteinů v bakulovirovém expresním systému stanovení MOI Exprese rekombinantního proteinu - subklonování adherentních bb. linií Transfer DNA, RNA – blotování pomocí vakua Northern blot, Southern blot Dot Blot proteinů Stanovení koncentrace proteinu densitometriií proteinu separovaného pomocí SDS PAGE Lektinová kolona – afinitní purifikace RACE Exprese rekombinantního proteinu - subklonování suspenzních bb. Linií Laboratorní metody z oblasti imunologie

Laboratorní metody z oblasti biochemie Precipitační metody purifikace peptidů a proteinů Digest proteinů v gelu a v roztoku 1D-ELFO a detekce proteinů v gelech 2D-ELFO příprava vzorku + separace + detekce + vyhodnocení Identifikace proteinů MALDI-TOF MS Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Slot blot a rychlý Western blot SNAP id Isoelektrická fokusace Nativní elektroforéza a detekce enzymů v gelu Nízkotlaká iontoměničová kapalinová chromatografie Gelová chromatografie Kovalentní modifikace proteinu in vitro Analýza postranslačních modifikací proteinu Stanovení produkce NO a RNS Analýza metabolitů RNS – NO2/NO3, nitrosothioly Stanovení aktivity enzymů metabolismu RNS - NOS, NR, GSNOR Detekce proteinů modifikovaných ROS a RNS

Laboratorní metody z oblasti biochemie Histochemické detekce ROS/RNS, HR, fenoly Detekce ROS a RNS konfokální mikroskopií Stanovení lipidické peroxidace Stanovení aktivity antioxidačních enzymů Enzymy metabolismu polyaminů Nanočástice – metody immobilizace enzymů Konstrukce amperometrických biosenzorů – oxidasy a dehydrogenasy Stanovení polyaminů a GABA s využitím HPLC Purifikace tRNA a identifikace modif. bazí Metody purifikace a analýzy cytokininů Příprava protoplastů z rostlinného materiálu Izolace organel – mitochondrie, peroxisomy, thylakoidy, vakuoly a jejich charakterizace Expesní systémy E.coli a P.pastoris a purifikace afinitní chromatografií Transformace rostlin mikroprojektilovým přenosem DNA + vizualizace chimerního proteinu BY-2 buňky – kultivace, transformace, synchronizace, stanovení mitotického indexu Transformace rostlin Agrobacteriem „Tomato hairy root transformation“ s detekcí GFP značeného transgenního proteinu Genotypizace odrůd vinné révy

molekulární a buněčné biologie Laboratorní metody z oblasti molekulární a buněčné biologie Digitální fotografie v biologii Kvantitativní a kvalitativní analýza digitálního obrazu Práce v aseptickém prostředí Morfologie živočišné buňky Kultivace živočišných buněčných linií Sledování viability a proliferace Transfekce buněk, selekce a detekce Colony formation assay Synchronizace živočišných buněčných kultur Modely angiogeneze in vitro Příprava buněk pro mikroskopickou analýzu Průkaz poškození DNA v buňkách FISH Průtoková cytometrie – buněčný cyklus (DNA) Průtoková cytometrie – detekce intracelulárních proteinů Průtoková cytometrie – detekce apoptózy Imunoprecipitace jako nástroj pro analýzu protein-proteinových interakcí Měření aktivity proteinkinas Biochemická detekce aktivity caspas

molekulární a buněčné biologie Ligandová specifita cytokininového receptoru (kvalitativní test) Interakce nízkomolekulárních látek s cytokinin oxidázou/dehydrogenázou (substrátová specifita a inhibice) Vazebný test ligand-receptor s živými buňkami – vsádková metoda Vazebný test ligand-receptor s buněčným lyzátem – rovnovážná dialýza Comet assay Analýza homologní rekombinace a NHEJ Mitotic spreads Sterilizace semen Homogenizace rostlinného materiálu Kořenový test Amarantový cytokininový biotest Senescenční cytokininový biotest s listy pšenice Kalusový cytokininový biotest ARR5:GUS cytokininový biotest Ligandová specifita cytokininového receptoru (kvantitativní test) Lokalizace exprese markerového genu v rostlinném pletivu Transformace E. coli elektroporací Kvantitativní real-time PCR Imunofluorescenční detekce DNA a proteinů v buňce Indukce poškození DNA Laboratorní metody z oblasti molekulární a buněčné biologie

Struktura modulu Textová část Obrazová dokumentace (rovnice, grafy…) Fotodokumentace Videosekvence Přednáška v PowerPointu Struktura modulu

Struktura textové části Stručný popis metody (anglicky a česky) Klíčová slova Teoretická část Experimentální vybavení (biologický materiál, chemikálie, roztoky, přístroje) Postup Fotodokumentace Vyhodnocení Příklady výsledků Možné problémy Literární odkazy Seznam zkratek Zkrácená verze postupu (česky, anglicky) Struktura textové části

Portál projektu www.aesculab.cz www.aesculab.portal.cz Možnost plná elektronická verze modulu stažení informací v pdf souboru účastnit se diskuse vkládat dotazy přihlásit se na workshopy Portál projektu

Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Zvolený rostlinný materiál Homogenizace, příprava vzorku

Nastavení experimentu Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Nastavení experimentu

Příprava gelu na SDS elektroforézu Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Příprava gelu na SDS elektroforézu

Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Skládání komůrky

Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Nanášení vzorku

Zapojení komůrky ke zdroji Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Zapojení komůrky ke zdroji

Příprava membrány a gelu na blotování Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Příprava membrány a gelu na blotování

Skládání komůrky na Western blot Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Skládání komůrky na Western blot

Western blot - detekce a kvantifikace hsp70

Vkládání gelu do 3% želatiny Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Vkládání gelu do 3% želatiny

Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Příklady výsledků 10% gel 7% gel

Western blot - detekce a kvantifikace hsp70 Při skládání jednotlivých vrstev do blotovací kazety dodržuj jejich správné pořadí! 2. Nezapomeň odstranit vzduchové bubliny mezi membránou a gelem ještě před začátkem blotování. 3. Do blotovací komůrky vkládej kazety vždy černou stranou k černé! 4. Při uzavírání blotovací komůrky víkem věnuj pozornost orientaci elektrod! Možné problémy