Řízená evoluce boolovských genetických obvodů v bakteriích David Beneš, Research Institute of the IT4Innovations Centre of Excellence, Faculty of Philosophy and Science, Silesian University in Opava ENBIK 2014

Obsah 1.Genetický obvod 2.Screening / selekce 3.Řízená evoluce 4.Duální selekce 5.Výsledky experimentů

Genetický obvod Vstup: protein (TF) Výstup: aktivace transkripce (ON/OFF)

Screening Dvoustavový obvod (ON/OFF) musí být testován na všechny různé stavy se všemi 4 kombinacemi vstupu.

Selekce Korektně fungující obvody zvýší šanci na přežití hostitele. Nekorektně fungující obvody jsou odstraněny úhynem hostitele.

Řízená evoluce Řízená evoluce pro výrobu genetických obvodů je iterativní proces sestávající z následujících kroků: 1)Vygenerování variant obvodu 2)Screening a selekce pro výběr nejlépe fungujících obvodů

Řízená evoluce Omezení řízené evoluce 1) Omezená velikost genetických knihoven 2) Omezená rychlost screeningu / selekce 3) Je vyžadováno množství laboratorních intervencí

Řízená evoluce ON selekce: přežijí jen bakterie s funkčním „záchranným“ genem (antitoxin 1) OFF selekce: přežijí jen bakterie bez funkčního „zabijáckého“ genu (toxin 2)

Řízená evoluce – duální protokol Běžný protokol: ON a OFF selekce opakovaně v různých prostředích nutnost laboratorních intervencí Duální protokol: ON selekce a OFF selekce mohou probíhat současně v tomtéž prostředí snižuje potřebu laboratorních intervencí screening a selekce probíhají co nejvíce autonomně

Duální selekce – pravdivostní tabulka InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010

Duální selekce –hradlo YES t1 – toxin 1 a1 – antitoxin 1 t2 – toxin 2 a2 – antitoxin 2 tfa – transkripční faktor (aktivátor) rel – relaxáza gfp – zelený flouorescenční protein

Duální selekce –legenda Bakterie se vstupním plazmidem (pSU2007) Bakterie s výpočetním plazmidem (RP4) Bakterie s oběma plazmidy E. Coli K12 derivative BW27783

Duální selekce – toxiny Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 ( ccdB-ccdA ) Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2 (hok-sok)

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR NOT TAUT YES NOT Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR NOT TAUT YES NOT Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR NOT YES Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR NOT YES Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :30:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :30:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :00:00

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :30:00 Toxiny / antitoxiny: CONTR – a1, t2 YES – a1, t1, a2, t2 Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES CONTR YES CONTR YES CONTR Fáze :00:00 Toxiny / antitoxiny: CONTR – a1, t2 YES – a1, t1, a2, t2 Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES Fáze :30:00 Toxiny / antitoxiny: CONTR – a1, t2 YES – a1, t1, a2, t2 Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES Fáze :00:00 Proteiny YES – rel Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES Fáze :30:00 Proteiny YES – rel Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES Fáze :00:00 Proteiny YES – rel Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2 YES

Duální selekce –hradlo YES InputYESNOTTAUTCONT 0 (Off) (On)1010 YES Fáze :30:00 Proteiny YES – gfp Antitoxin a1 ruší efekt toxinu t1 Antitoxin a2 ruší efekt toxinu t2 YES

Duální selekce –Fáze 1 - hradlo NOT

Duální selekce –Fáze 2 - hradlo NOT

Fáze 1

Fáze 2

Děkuji za pozornost!