Metody molekulární biologie MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D. Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno Brno 2003

Genomika – studium genomu 1. Strukturální - identifikace genů - umístění genu na chromozomu (fyzické mapování) - stanovení nukleotidové sekvence genu 2. Komparativní - mezidruhové srovnávání, evoluční studie 3. Funkční (RNA genomika) - genová exprese (jak geny fungují) 4. Farmakogenomika - využití genetiky při vývoji vakcín Proteomika – studium proteinů

Využití metod molekulární biologie Teorie objev nových genů a proteinů zkoumání mechanismu regulace eukaryontních genů studium funkce proteinů poznání evoluční historie eukar. genu (fylogenetické mapy) Praxe diagnostika původců infekčních onemocnění diagnostika genetických chorob (mutace v DNA), léčba farmaceutický průmysl – léky (př. inzulín pro diabetiky) potravinářství (identifikace přídavků do potravin) genové inženýrství (geneticky modifikované organismy) soudní lékařství - kriminalistika (identifikace osob) - testování paternity a maternity testování identity jedinců vzácných zvířat ověřování rodokmenů zvířat

Metody molekulární biologie Izolace DNA Materiál tělní tekutiny (krev, plodová voda, sliny) tkáně (vlasy, orgány) organismy (bakterie, viry, kvasinky, paraziti, rostliny, hmyz) čerstvý/zmrazený/parafinovaný materiál Postup komerční kity (enzym - proteáza, pufry, kolonky), izolace 20 min   fenol chloroformová extrakce  

Metody molekulární biologie - klonování 1. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Vytvoření (amplifikace) identických kopií určitého úseku DNA v přístroji „termocycler“ (K.Mullis, 1983) Do reakce se dává testovaná DNA synteticky připravené primery (krátké úseky DNA) nukleotidy ve formě trifosfátů (ATP, TTP, CTP, GTP) enzym Taq polymeráza (z bakterie Thermus aquaticus) pufr obsahující Mg2+ ionty Fáze PCR denaturace DNA annealing – nasednutí primerů na komplementární úsek DNA extension – napojování nukleotidů

Polymerázová řetězová reakce (PCR) 1 cyklus PCR 94 – 95oC 50 - 60oC 72oC denaturace annealing extension Při 30 cyklech - amplifikace více než 109 kopií úseku DNA

Polymerázová řetězová reakce (PCR) Typy PCR Jednoduchá PCR Nested, semi-nested PCR Koamplifikační, multiplexová (comultiplex, multiplex PCR) Reversní transkripční PCR (RT-PCR) Semikvantitativní, kvantitativní PCR - Komparativní (Q-PCR) - Kompetitivní (QC-PCR) - PCR v reálném čase (Real-time Q-PCR)

2. Namnožení úseku DNA v bakteriích Metody molekulární biologie - klonování 2. Namnožení úseku DNA v bakteriích Plazmidový klonovací vektor - malá kruhová molekula DNA (plazmid bakterie E.coli) musí obsahovat replikační počátek musí mít místo pro restrikční endonukleázu musí mít gen pro rozlišitelnou vlastnost (rezistence k antibiotikům) Postup rozštěpení vektoru restrikční endonukleázou začlenění fragmentu DNA do vektoru DNA-ligázou (enzym) začlenění plazmidu s fragmentem DNA do bakterie po namnožení bakterie, lýza bakterii a uvolnění plazmidů vyštěpení fragmentu DNA z plazmidů restrikční endonukleázou

Genomová knihovna (chromozomální DNA) Lidská DNA Fragmenty genomové DNA Rekombinantní DNA Inzerce DNA-fragmentů do plasmidů Vnesení plasmidů do bakterií Rozštěpení DNA restrikční endonukleázou

cDNA knihovna (komplementární DNA) - lýza buněk tkáně a izolace mRNA pomoci enzymu reverzní transkriptáza přepis do sekvence DNA (cDNA= complementary, komplementární DNA) naklonování molekul cDNA do plazmidových vektorů Výhoda: geny v této knihovně jsou bez intronů !!!

Metody molekulární biologie Gelová elektroforéza Princip Oddělení fragmentů DNA podle velikosti Postup příprava gelu – agarózový, polyakrylamidový gel   obarvení vzorku – ethidium bromid, bromfenolova modř nanesení vzorku na gel - nastavení napětí a doby elektroforézy    zviditelnění fragmentů DNA - UV transluminátor

Příklad výsledku gelové elektroforézy 1-7: pozitivní výsledek - amniové tekutiny gravidních žen (362 bp sekvence) 8: negativní kontrola 9: pozitivní kontrola (362 bp sekvence T. gondii) 10: 50 bp velikostní standart (ladder)

Metody molekulární biologie PCR/RFLP restriction fragment length polymorphism Fáze amplifikace specifického úseku DNA pomoci PCR štěpení enzymem „restrikční endonukleáza“ při 37oC 1h analýza štěpných fragmetů DNA na agarózovém gelu místo štěpení 5´ HaeIII 3´

RFLP Restrikční mapy - fyzická mapa štěpných míst v DNA studium polymorfismu mezi druhy, v rámci druhu mezi kmeny, skupinami (fingerprinting) př. alfa-globinový gen (studium příbuznosti Ho a ostatních primátů) Přehodnocování systematického zařazení jednotlivých organismů

Metody molekulární biologie Southern blotting Princip: přenos DNA (jednořetězcové) z gelu na nylonovou nebo nitrocelulózovou membránu na přístroji „vacuum blotter“ Postup: štěpení DNA restrikční endonukleázou elektroforéza depurinace DNA v HCl, denaturace DNA v NaOH Southern blotting (blotování) - pod vakuem 90 min. (3 vrstvy filtračního papíru, nylonová membrána, gumový rám, gel s DNA) - kapilární

Metody molekulární biologie Hybridizace Princip: Hybridizace = renaturace (proces obnovení vodíkových můstků mezi komplementárními bázemi), pomoci DNA sond se vyhledávají specifické nukleotidové sekvence. DNA sonda: krátká jednořetězcová DNA (10-1000 nukleotidů), značena - radioaktivně (izotop 32P) - neradioaktivně (chemiluminiscence) Postup: uzavření membrány do plastikového sáčku spolu se značenou sondou hybridizace (navázání sondy na komplementární úseky DNA) vymytí membrány (odstranění nenavázané sondy) detekce - autoradigrafie - detekční látky (hydrogen peroxid a luminol) – fotograf.film

Elektroforéza, Southern blotting a hybridizace Metody molekulární biologie Elektroforéza, Southern blotting a hybridizace neznačená rozštěpená DNA nitrocel. papír nitrocelul. papír s DNA agarózový gel mycí houba alkalický roztok Elektroforéza Souhthern blotting Hybridizace sonda autoradiograf

Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování) Metody molekulární biologie Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování) Enzymová metoda Použití přístroje „sekvenátor“ Genová banka NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Kompletní genom (údaje ke konci roku 2003) Eukaryota: 20 (Avena sativa, Glycine max, Hordeum vulgare, Lycopersicon esculentum, Oryza sativa, Triticum aestivum, Zea mays, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Danio rerio, Anopheles gambiae, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Encephalitozoon cuniculi, Guillardia theta, Sacharomyces cerevisiae, Plasmodium falciparum, Schizosacharomyces pombe) Prokaryota: 17 (archebakterie), 128 (bakterie) Viry: 1656

Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování) Metody molekulární biologie Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)

Genové inženýrství Využití: Výroba buněčných proteinů ve velkém množství (insulin, růstový hormon, plášťové proteiny virů pro očkování….) Syntéza velkého množství RNA (studium proteosyntézy) Genová terapie Výzkum nových genů Transgenní organismy – ve svém genomu obsahují nové geny, nebo geny pozměněné metodami rekombinantní DNA Klonování zvířat – 1996 (ovce), 1998 (skot, myš, koza), 2000 (prase, muflon), 2001 (kočka, divoký tur gaur), 2002 (králík), 2003 (mula, divoký tur banteng) (zdroj časopis 21. století/ 8. číslo, www.osel.cz)