Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy David Zeman1,2, Ludmila Nováčková1 1ÚKB a 2Neurologická klinika FN Ostrava

Obecné schéma likvorové diagnostiky

Přehled metod likvorové diagnostiky STATIMOVÝ PROGRAM: vzhled před centrif., po centrifugaci počet elementů a ery ve FR Hb (kvalit.), Pandy CB, glukóza, laktát cytologický preparát IMUNOCHEMICKÁ VYŠ. - základní panel: Q-Alb (Alb-CSF/Alb-S) Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA, výpočet lokální (intrathékální) syntézy oligoklonální IgG (izoelektrická fokusace se specifickou detekcí IgG)

Likvorová diagnostika u RS: „pozitivní CSF“ v diagnostických kritériích Poser a kol. 1983: „laboratorní podpora“ dg. RS = průkaz oligoklon. IgG pásů v likvoru nebo zvýšené syntézy IgG v CNS (IgG index); „OCB nesmí být v séru a sérová koncentrace IgG musí být normální“ McDonald a kol. 2001: oligoklon. IgG pásy v moku nepřítomné v séru, detekované nejlépe metodou IEF, a/nebo zvýšený IgG index; lymfocytární pleocytóza <50 buněk/μl; pozitivní CSF obligátní pro podporu diagnózy primárně progresívní RS Polman a kol. 2005: pro diagnózu primárně progresívní RS nemusí být pozitivní CSF, je-li pozitivní MR mozku (9 T2 lézí nebo  4 léze + pozitivní VEP) i MR míchy (2 fokální T2 léze) Podle všech 3 uvedených diagnostických kritérií je vyšetření CSF pro diagnózu RS potřebné pouze v určitých vyjmenovaných situacích

Diagnostická kritéria RS: rozprostřenost v prostoru Klinický průkaz  2 lézí MR – 3 ze 4 kritérií: 1 Gd-enhancující léze nebo 9 T2-hyperintenzních lézí 1 infratentoriální léze 1 juxtakortikální léze 3 periventrikulární léze Při pozitivním likvoru je kritérium naplněno, jsou-li na MR 2 ložiska kompatibilní s diagnózou RS !!!

Diagnostická kritéria primárně progresívní RS Progrese nemoci 1 rok a zároveň 2 z následujících 3 kritérií: Pozitivní MR mozku (9 T2 lézí nebo 4 T2 léze a zároveň pozitivní VEP) Pozitivní MR míchy (2 fokální T2 léze) Pozitivní likvor

Likvorová diagnostika RS Praxe v ČR: každý pacient se susp. RS má vyšetřen likvor – i v případech, kdy to mezinárodní diagnostická kritéria nevyžadují Podobný postoj v SRN – podle směrnic DGN (www.dgn.org) „vyšetření likvoru hraje v diagnostice RS nadále ústřední roli, zejm. slouží k odlišení od infekčních nemocí (např. borreliózy), lokální syntéza IgG a IgM poukazuje na chronický zánětlivý proces a má i význam prognostický“ ROZSAH VYŠETŘENÍ: Směrnice DGN (www.dgn.org): cytologie, Q-Alb, Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA, oligoklonální IgG, AI pro neurotropní viry (MRZ reakce), při klinickém podezření též AI pro borrelie Směrnice DGLN (www.dgln.de): počet buněk a jejich diferenciace, CB, Q-Alb, ith. syntéza IgG, IgM, IgA, oligoklon. pásy, AI (M, R, Z, borrelie) jsou obligátní testy; laktát a Q-glukosy jsou fakultativní testy

Doporučení pro likvorovou diagnostiku RS Andersson a kol. 1994: CSF in the diagnosis of MS: a consensus report: komplexní zpracování problematiky, pro detekci intrathék. syntézy IgG doporučena IEF se specifickou detekcí IgG Freedman et al. 2005: Recommended standard of CSF analysis in the diagnosis of MS: nejdůležitějším vyšetřením je detekce oligoklonálního IgG metodou IEF s následnou imunodetekcí (blotting nebo fixace) Franciotta et al. 2005: Consensus recommendations of the Italian Association for Neuroimmunology for immunochemical CSF examination Link, Huang 2006: Oligoclonal bands in multiple sclerosis cerebrospinal fluid: An update on methodology and clinical usefulness

Likvorová diagnostika RS - cytologie Počet buněk: - v 60 % mírně zvýšen (4-50/μl) - vzácně (cca 1 %) mezi 50-100/ μl - hodnoty nad 100/μl diagnózu RS zpochybňují! (neuroinfekce) Diferenciální cytologie: - většinou lymfocytární reakce, <10 % aktivovaných B-lymfocytů a plazmocytů - vzácněji monocytární reakce nebo (10-15 %) normální cytologický nález -nikdy významné zastoupení segmentů

Cytologické nálezy u RS

Cytologické nálezy u RS II. lipofág (vlevo), pěnitá buňka (vpravo)

Likvorová diagnostika RS – biochemie a imunochemie Celková bílkovina: normální nebo mírně zvýšená (<0,80 g/l) Q-Albumin (CSF/S)*103: - v 70-80 % normální - vzácněji mírně zvýšen (<10) - vzácně mezi 10 – 20 Glukosa (CSF/S) a laktát: pro dg. RS fakultativní parametry (ale mohou být užitečné v diff. dg.) Intrathékální syntéza imunoglobulinů: - IgG (kvantitativně cca v 70-75 % případů, kvalitativně v 90 – 98 % případů) - IgM (pravděpodobnost agresívnějšího průběhu nemoci u RR a SP formy) - IgA (<10 % případů; je-li dominantní  pochybnosti o diagnóze RS)

50 let oligoklonálního IgG Holmoy T. Eur Neurol 2009, 62: 311-315 CSF pacienta s SSPE: subfrakce 1 - 4 (Karcher et al. 1959) Elfo v agarovém gelu

50 let oligoklonálního IgG Holmoy T. Eur Neurol 2009, 62: 311 - 315 První jasný průkaz oligoklonálního IgG v CSF (Lowenthal et al. 1960) – elfo v agarovém gelu Pozitivní oligoklonální pásy u RS  v patogenezi RS se uplatňují klonálně expandované lymfocyty 1 = RS; 2 = SSPE; 3 = normální kontrola; 4 = neurosyfilis; 5 = afr. trypanosomiáza

Oligoklonální IgG (vlevo) a fKLC (vpravo) u pacienta s SSPE vlastní výroba - ÚKBLD 1. LF UK Praha 2002 AFINITNÍ IMUNOBLOTTING IgG: Sw anti-Hu IgG antisérum pro potah a Sw anti-Hu IgG: HRP (Sevapharma) pro detekci fKLC: metoda s kombinací anti-Hu fKLC polyklonální Ab pro potah a polyklonální anti-Hu(f+b)KLC:HRP (DAKO) pro detekci (Lamers et al., 1995): problém křížové reaktivity

IgG: „Quantity versus quality“ Hodnocení: Typ 2 – intrathékální syntéza. Komentář: V moku 3 pásy v perineutr. oblasti bez sérového korelátu. Proká-zána lokální produkce oligoklon. IgG.

Oligoklonální IgG dnes IEF + imunofixace v gelu (SEBIA) Pozice 4: Dívka 15 let, dg: inoperabilní míšní nádor CSF: 44/3 elem, cytol.prep. - 90 % lymfo, 2 % plazmo, 8 % mono; CB 0,28 g/l, glukosa 3,3 mmol/l, Q-Alb*103 4,00, ith. syntéza IgG výpočtem neprokázána, ale 11 OCB v moku bez sérového korelátu Revize dg: RS

OLIGOKLONÁLNÍ IgG 5 typů podle mezinárodní klasifikace TYP 1: normální (negativní) nález – žádné pásy v moku ani v séru TYP 2: lokální (intrathékální) syntéza - 2 pásy v moku, žádné pásy v séru TYP 3: lokální (intrathékální) syntéza + „systémová“ syntéza: 2 pásy v moku, které nejsou v séru + společné pásy v moku i v séru TYP 4: „systémová“ syntéza, pasívní přestup sérového oligoklonálního IgG do moku; žádná intrathékální syntéza!! – společné pásy v moku a séru TYP 5: obraz paraproteinu – společné pásy v moku a séru (blízko sebe, intenzita stoupá směrem ke katodě)

Oligoklonální IgG – „hraniční“ nálezy 1 pás v moku  typ 1 - není intrathékální syntéza (doporučení DGLN) Z toho nepřímo vyplývá: 1 společný pás v moku i v séru  typ 1 (není OLIGOklonalita) Ale: 1 společný pás v moku i v séru + 1 pás v likvoru bez korelátu v séru  typ 1 nebo typ 4 ? Migrační mikroheterogenita: typ 1 nebo typ 4 ? (v žádném případě nejde o intrathékální syntézu)

Oligoklonální IgG - příklady

Příklad likvorového nálezu u RS 32/3 elem CB 0,246 g/l CSF-albumin 112 mg/l CSF-IgG 112 mg/l S-albumin 39 g/l S-IgG 11,2 g/l Q-Alb 2,87*10-3 Q-IgG 10*10-3 oligoklonální IgG: 18 pásů v moku, 0 v séru

Příklad likvorového nálezu u RS: cytologie lymfocyty 77 %, plazmocyty 4 %, monocyty 19 % Nečetné aktivované lymfocyty a monocyty, ojedinělé mírně atypické lymfocyty v.s. v rámci zánětlivé aktivace Závěr: Lymfocytární pleocytóza s plazmocytární reakcí – obraz nehnisavého zánětu, výtečně kompatibilní i s uvedenou dg. RS.

Oligoklonální IgG – dynamika nálezu: případ 1 Vlevo: 17. 9. 2009: 7 pásů v moku, 5 v séru - typ 3 Vpravo: 14. 5. 2010: 7 pásů v moku, 4 v séru - typ 3 Neměnná poloha a počet pásů podporují dg. RS … ale POZOR! Lze srovnávat pouze stejnou metodu na stejném pracovišti !!!

Likvorová diagnostika RS – specifické protilátky, MRZ reakce MRZ reakce: protilátky proti virům spalniček (Measles), zarděnek (Rubella) a varicella Zoster s výpočtem lokální protilátkové syntézy – protilátkového indexu (antibody index – AI): průkaz polyspecifické imunitní odpovědi – RS, systémová autoimunita s postižením CNS (zde diff. dg.: autoprotilátky v séru), větší specificita pro RS než u oligoklonálního IgG (negat. u chron. neuroinfekcí, NMO, PND) U pacientů s RS jsou zvýšené hodnoty AI: M 78 %, R 65 %, Z 55 %; MRZ > 90 % (pozitivita protilátek k 1-3 antigenům) V průběhu RS se může pozitivita objevit nově a zvýšený M-AI je spojen s rychlejší progresí nemoci (Petereit, Reske 2005) M a R protilátky významnější pro diagnostiku RS než Z (Brettschneider a kol. 2009) Intrathék. syntéza antiborre- liových protilátek (AI): dif. dg. význam (může však být i v rámci polyspecifické imunitní odpovědi u RS)

Co potřebujeme vědět pro výpočet intrathékální syntézy Ig Kvocient albuminu Q-Alb = CSF-Alb/S-Alb Kvocient IgG, IgA, IgM (obecně každého plazmatického proteinu) Q-IgX = CSF-IgX/S-IgX IgG, IgA, IgM index = Q-IgX/Q-Alb Historické metody výpočtu intrathékální syntézy Ig: a) extendovaný Ig index (Öhman): Q-IgX/(Q-Alb)a b) Tourtellotův vzorec: [(CSF-IgG – (S-IgG/615))-(CSF-Alb – (S-Alb/291))*(S-IgG/S-Alb)*0,43)]*5 = intrathékální syntéza IgG v mg/den Q-Alb > Q-IgG > Q-IgA > Q-IgM ; obrácení některé z těchto nerovností svědčí pro i.th. syntézu

Výpočet intrathékální syntézy Ig – Reiberova hyperbolická funkce

Parametry Reiberovy hyperbolické funkce Ig hodnota a/b b^2 *10^6 c*10^3 IgG Q-Lim 0,93 6 1,7 Q-Mean 0,65 8 1,4 Q-lower lim 0,33 2 0,3 IgA 0,77 23 3,1 0,47 27 2,1 0,17 74 1,3 IgM 0,67 120 7,1 306 5,7 0,04 442 0,82

Výpočet intrathékální syntézy Ig IgXLOC = (Q-IgX – QLim-IgX) x S-Ig [mg/l ] IgXIF = 1 – (QLim-IgX/Q-IgX) x 100 [%] Podle intrathékální frakce IgXIF posuzujeme dominanci intrathékální Ig syntézy v jednotlivých třídách (např. ith. IgM = 80%, ith. IgG = 25%: IgMIF > IgGIF)

Protilátkový index (AI) (Reiber a Lange 1991) AI = Q-Ig spec/Q-Ig, je-li Q-IgQ-lim AI = Q-Ig spec/Q-lim, je-li Q-Ig>Q-lim AI  1.5 svědčí pro lokální (intrathékální) syntézu specifických protilátek

Specifické oligoklonální IgG IEF  afinitní imunoblotting na membránu inkubovanou s relevantním antigenem (neuroinfekce – HSV, M. tuberculosis, borrelie, …; RS – řada perspektivních Ag-ů /neurotropní viry, složky myelinu, … /, přesto dodnes neznáme antigenní specifitu většiny lokálně syntezovaného IgG) Postup: 1. Potah membrány roztokem relevantního antigenu (6-24 hod), 2. Blokování volných vazebných míst (30-90 min – v průběhu IEF), 3. Blotting (30-60 min), (4. fixace 0,1% - 0,25% glutardialdehydem), 5. Inkubace membrány se značenou protilátkou ( 60 min), 6. Detekce

Oligoklonální IgG (vlevo) a oligoklonální antiborreliové IgG (vpravo) nahoře: 1. vzorek (9/2007) dole: 2. vzorek (8/2008)

Nehnisavé neuroinfekce I. Klíšťová meningoencefalitida 1. LP (13. 6. 2000): CSF lehce zkal., po centrif. čb 906/3 elem, 80/3 ery, CB 0.91 g/l, glukóza 4.25 mmol/l, laktát 1.95 mmol/l Kontrolní LP (10. 7. 2000): CSF čb, 167/3 elem, 5/3 ery, CB 0.55 g/l, glukóza 2.9 mmol/l, Q-Alb 7.2, i.th. IgG 43% (38 mg/l), i.th. IgM 94% (91 mg/l), i.th. IgA 0%

Nehnisavé neuroinfekce II. Muž 64 let, meningo- polyradikuloneuritický sy. CSF: čb, 728/3 elem, 2/3 ery, cytologie: Ly 88%, Plb 7%, Mo 4.5%, Neu 0.5% CB 1.26 g/l, glukóza 4.2 mmol/l, laktát 2.3 mmol/l, Q-Alb 19.2, i.th. IgG 30% (78 mg/l), i.th. IgM 63% (16 mg/l), i.th. IgA 0%, fLC-index 7, oligo-f LC pozitivní.

Diferenciální diagnostika Obraz nehnisavého zánětu Roztroušená skleróza: pleocytóza mírného stupně, popř. chybí, CB a Q-Alb zprav. norm., i.th. syntéza IgG, popř. + IgM) Systémová autoimunitní onemocnění s postižením CNS Jiná „chronická zánětlivá onemocnění autoimunitního typu“ (NMO, PND) Nehnisavá neuroinfekce Reakce na parameningeální zánětlivý proces (cave spondylodiscitis, sinusitis, otitis!) Mozkový absces (i.th. syntéza IgA !!) Neurotuberkulóza (CB a Q-Alb , laktát , Q-glukózy , i.th. syntéza IgA !! ; PCR!) Neurobrucelóza

Diferenciální diagnostika nehnisavý zánět x meningeosis lymphomatosa/leukaemica

Závěr likvorového vyšetření Popis cytologického preparátu Výsledky jednotlivých stanovení, výpočet Q-Alb, Q-Ig, intrathékální syntézy Ig v % a v mg/l, AI Výsledek vyšetření oligoklon. IgG Diferenciálně – diagnostický rozbor: normální nález nespecifické změny zánětlivý proces (hnisavý/nehnisavý, akutní/chronický, „infekční“/autoimunitní) nádorové postižení krvácení do likvor. cest

Perspektivy I.: volné lehké řetězce (fLC) Kvantifikace v CSF: řádové rozpory v publikovaných studiích (pro fLLC až o tři řády!!), ale shoda o významně zvýšených hodnotách fKLC u RS 1) latex-enhanced nefelometrie (FreeLiteTM) – problematické v normálních likvorech 2) ELISA a) BioVendor – sendvičová metoda b) „home-made“ kompetitivní nebo sendvičové metody fLC v moči: slibný marker aktivity nemoci (Mehta et al. 1991, 1998) – opakovaná vyšetření; nemají význam diagnostický Oligoklonální fLC: detekce v párovém vzorku likvoru a séra a srovnání Srovnání obou přístupů: Diagnostický význam pro fKLC, nejasný pro fLLC Nelze s jistotou deklarovat přednost detekce oligoklonality oproti kvantifikaci

Oligoklonální IgG – negativní, typ 1 (nahoře), fKLC (dole vlevo) i fLLC (vpravo) pozitivní v CSF Pacient s akutní nehnisavou neuroinfekcí

Perspektivy II: Oligoklonální IgM Prognostický význam u RS (RR, SP) - pozitivita implikuje agresivnější průběh nemoci Prognostický význam má patrně lokální syntéza IgM proti myelinovým lipidům – fosfatidylcholinu a/nebo sfingomyelinu (RR-RS 30 %, SP-RS 60 % x PP-RS 0 %) Metodicky obtížné, nicméně metoda detekce celkového i specifického oligoklonálního IgM byla publikována (Villar et al. 2001, 2005)

Oligoklonální IgM Villar et al., J Immunol Methods 2001,258:151-155 50 mM DTT 30 min, RT IEF, imunoblotting Chromogenní detekce (BCIP/NBT) s protilátkou značenou ALP A – OCB patrné až do koncentrace 0,025 mg/l (0,125 ng/pozici) B – žádná křížová reaktivita s IgG

Oligoklonální IgM Schneider et al., Eur J Neurol 2007, 14: 907-911 Afinitní imunoblotting, chemiluminiscenční detekce Vzorky „treated with dithiothreitol to facilitate IgM migration“ 2 páry CSF + S vlevo pozitivní, 2 páry vpravo negativní Ve všech vzorcích pozorováno „a slight separation of IgM“ Nekorelují s rizikem relapsu u pacientů s CIS

Oligoklonální IgM se specifitou proti myelinovým lipidům Villar et al Oligoklonální IgM se specifitou proti myelinovým lipidům Villar et al., J Clin Invest 2005, 115: 187-195

ZÁVĚR Nejdůležitějším vyšetřením v likvorové diagnostice RS je detekce oligoklonálního IgG Zejména z diferenciálně-diagnostických důvodů je nezbytné též stanovení počtu buněk a jejich diferenciace (lépe v trvalém preparátu), Q-Alb (stav H-L bariéry), Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA a AI (M, R, Z, popř. borrelie, HSV) k posouzení intrathékální syntézy „celkových“ i specifických protilátek Perspektivními testy jsou stanovení/detekce volných lehkých řetězců, oligoklonální IgM a různé specifické protilátky (AI, oligoklonální specif. protilátky) V blízké budoucnosti lze čekat upřednostnění detekce oligoklonálních IgM, IgA a fLC pásů před výpočty intrathékální syntézy