Cytogenetická laboratoř OLG FN Brno Onkocytogenetika Cytogenetická laboratoř OLG FN Brno

Historie nádorové cytogenetiky 1914 - Boveri: chromozomová teorie vzniku nádorů nádorové buňky vznikají z původně normálních buněk, abnormální chování je zakotveno uvnitř buňky, ne v jejím okolí nádorové buňky mají abnormální obsah chromatinu, každý nádor je založen jednou, jedinou buňkou

První cytogenetický nález 1962 - Ph chromosom CML 1972 - nalezena reciproká translokace t(9;22) princip: vznik fuzního genu (bcr/abl) produkce nádorového proteinu ( chimerický protein) t(9;22)(q34;q11) 95% CML 2% AML 25-30% ALL

Současné hypotézy nádorové transformace Příčina: ztráta regulace buněčné proliferace, nesmrtelnost (inaktivace TU supresorů nebo buněčných inhibitorů, aktivace onkogenů) mechanismus: mutace, delece, poziční efekt diploidní buňka - omezený počet dělení, zkracování telomer transformovaná - neomezený růst a dělení

Telomery Nukleoproteinové konce chromozomů tandemově opakující se motiv TTAGGG (všichni savci, některé rostliny) význam: stabilita CH, ochrana před degradací a slepováním konců zkracování CH:replikace DNA na 3´konci neprobíhá prim. replikačním systémem  zkrácení CHzastavení b.cyklu telomeráza: ribonukleoproteinový enzym, doplňování telomer, syntéza telomerové DNA reverzní transkripcí vlastní mol. RNA aktivita telomerázy potlačena v diferencovaných bb.omezená životnost (replikační kapacita) zárodečné tk., nediferencované bb., nádorové bb.: aktivita telomerázy vysoká nesmrtelnost tumorový marker

Používané cytogenetické metody Klasická cytogenetika: G-pruhy FISH: všechny typy sond CGH:detekce delecí a amplifikací M-FISH: MetaSystems, Lucia SKY: spektrální karyotypování M-bandy microarrays - genové sondy, podskupiny chorob s různou léčebnou odpovědí

Význam cytogenetických vyšetření Součást diagnostiky: vyšetř. hematologické, histologické, imunofenotypizační, cytogenetické event. molekulárně genetické cytogenetické výsledky přispívají: ke stanovení prognozy k volbě léčebného postupu monitorování průběhu onemocnění sledování minimální residuální choroby

Hematoonkologická onemocnění Charakter klonální - postihují kmenové krvetvorné buňky rozdělení: leukemie (difuzní) lymfomy (ložiskovitá) etiologie multifaktoriální mutace v 1 hemopoetické buňceneoplastická proliferaceklon myeloblastické leukemie - mutace v multipotentní kmenové b. se schopností diferenciace do linie: erytroidní, granulocytární, monocytární, megakaryocytární lymfoblastické leukemie - prekurzor s diferenciací do T nebo B leukemie bifenotypické- diferenciace do obou řad akutní- týdny až měsíce chronické - měsíce až roky

Klinické projevy leukemií důsledkem proliferace leukemických buněk a jejich infiltrace do tkání, narušení funkce orgánů Vysoké nároky na metabolismus infiltrace kostní dřeně  anemie, neutropenie trombocytopenie projevy onemocnění: únava, infekce horních cest dýchacích nereagující na standartní antibiotickou léčbu, zvýšené teploty, krvácivé projevy kožní a slizniční, petechie, krvácení z nosu a dásní, bolesti kloubů, vysoké teploty Diagnoza AL:morfologicky, imunohistochemicky, histologicky, cytogeneticky, mol. gen.

Význam cytogenetických vyšetření u leukémií Cytogenetické výsledky přispívají: ke stanovení prognozy, k volbě léčebného postupu, k hodnocení léčebné odpovědi, k monitorování průběhu onemocnění AML potvrzen vztah mezi CHA, podtypem AML a prognozou CH změny klonálního charakteru u 60 - 90% nemocných Dobrá prognoza: t(15;17)(q22;12) 99% AML M3 promyelocytární PML/RARa-podporuje účinek kys.-trans-retinové změna prognozy na nejlepší, 90% kompl. remisí t(8;21)(q22;q22) - 40% AML M2 inv(16)(p13q22) - AML M4 eo, t(16;16)(p13;q22), del(16)(q22) Špatná prognoza: tMLL(11q23) s různými CH 10-20%AML aberace: -5/5q-, -7/7q-, 3q, komplexní karyotypy

Myeloblastické leukemie Poruchy vyzrávání buněk myeloidní řady více než 20% blastů v KD výrazná převaha erytroidní proliferace Blasty - nezralé buňky obsahující granula Chromozomové změny korelují s podtypem prognosticky významné cytogenetická remise

Akutní myeloidní leukemie Frekvence vzniku nových onemocnění: 4/100 000/rok převaha u dospělých Charakteristika: akumulace nezralých nonlymfoblastických bb v: kostní dřeni, periferní krvi, ostatních tkáních Důvod: 1. Zvýšená proliferační aktivita, blokáda vyzrávání, narušení norm. diferenciace myeloidních buněk 2. Redukce apoptozy FAB klasifikace: AML skup. M0 - M7 podle převládající diferenciace a stupně vyzrávání

Myeloproliferativní syndrom MPD CML, polycytemia vera, esenciální trombocytemie, myelofibroza patologická transformace pluripotentní buňky  diferenciace v řadu granulocytární, erytroidní, megakaryocytární konečné stadium - blastická fáze ( akutní sekundární leukemie ) CML nadprodukce granulocytů a megakaryocytů v KD vznik nových CML 1/ 100 000 / rok I. Chronická fáze - až 3 roky, II. akcelerace, III. blastická krize II. a III. zvýš. počet nezralých bb v KD a PK, progresivní anemie a trombocytopenie t(9;22) = Ph = bcr/abl sekund.: +8, i(17q), +19 méně časté: +21,-Y,-7,-17, +17 !! 5-10% bez Ph s bcr/abl, horší prognoza, odlišné klin. příznaky, +8,-7, i(17q),+17

Polycytemia vera (PV) Charakteristika: zvýšená produkce červených krvinek-poruchy cirkulace, trombotické stavy cyto: 20q-, +8, +9, 1q+, 13q-, t(X;1) Esenciální trombocytémie) (ET) zvýšení trombocytů, červených krvinek, deficience Fe prognoza nezávislá na přít. CHA cyto: t(9;22), +9, -7, +8, 13q-, 20q-, přestavby 1 Idiopatická myelofibroza (IMF) zmnožení vayiva v KD na úkor krvetvorné tkáně,snížená tvorba červených+bílých krvinek 10-15% riziko AML cyto:-7, +8, +9, aberace 1q, 5q, 13q, 20q

Myelodysplastický syndrom (MDS) Dysfunkce KD, heterogenní skupina-dysplastická hematopoeza ve 2 a více buněčných liniích, kompletní ztráta kontroly proliferace a diferenciace hemopoetické buňky klinický obraz: periferní pancytopenie 20-40% přechod do AML 1/3 pacientů umírá na dysfunkci kostní dřeně bez vývoje AML 1/3 " “ na jiné příčiny hematologické nálezy: anemie, leukopenie, granulocytopenie, trombocytopenie I. Refrakterní anemie RA s prstenčitými sideroblasty s excesem blastů RAEB v transformaci RAEBt II. chronická myelomonocytární leukemie CMML

MDS - chromozomální změny Strukturní: 5q31 tumorový supresor del 5q ( terminální, intersticiální) prognoza ! del 7q, del 20q Numerické: -5, -7, +8, +9, +19, +21, -X, -Y CMML počet blastů 5 - 20% cyto: -7, +8, -Y Sekundární MDS důsledek terapie jiný ch maligních onemocnění cyto: -7, del 5q, -5, del 7q, +8, -12, t(1;7), der(3p), der(6p), der(12p),der(17p), der(21q)

Lymfoidní malignity Chromozomové změny - prognostický faktor u ALL korelují s podtypem definovaným morfologicky a imunologicky detekce u 70 - 95 % případů ALL 70% dětských ALL dosahuje kompletní remise !!!! lymfocyty produkovány: lymf. uzlinami, slezinou, thymem, KD primární lymfopoetické org.: thymus, KD sekundární: l. uzliny, l. tkáně střeva, slezina největší masa lymfopoetické tkáně v KD, zdrojem kmenové bb. Plasmatické bb.: konečné st. vývoje B lymfocytů

Akutní lymfoblastická leukemie - ALL Akumulace maligních nezralých lymfoidních buněk v KD, často i v periferní krvi výskyt: nová onemocnění 3/100 000/rok častěji děti 3-5let, dospělí pod 30 let FAB klasifikace ( cytomorfologicky) L1 - L3 cytogenetika: numerické zmeny:hyperdiploidie 51-60 dobrá prognoza 47-50 střední trisomie 18, 21, X, 4, 6, 10, 14, 17, 20 hypodiploidie špatná progn., 8%dospělých 5%dětí monosomie 20

Strukturní změny u T-ALL t(9;22) velmi špatná progn., 17-30% dosp., 2-6%dětí přestavby v oblasti minor t(1;19)(q23;p13) ; fuzní gen E2A/PBX1, příznivá progn. dlouhodobá kompl. remise po intenzivní chemoterapii t(4;11) MLL/AF4 velmi nepříznivá progn., 50% kojenců 2% dosp., 5%dětí všechny přestavby 11q23 (MLL) velmi špatná progn. t(12;21) TEL/AML1 30% dětí, dospělí vzácně, rychlá remise, dobrá progn. detekce FISH B-ALL: 25-30% norm. karyotyp, změny postihují 1 z T-buněč. receptorů TCR , ( 14q11), TCR(7p15), TCR (7q35) detekce mol. gen., t(8;14) u T i B-ALL stejná cyto: del 6q, 9p, 12p

Chronická lymfatická leukemie CLL % změn variabilní, závislost na použité technice +12 (15%) samostatná změna, jen B-lymfocyty, pokročilé st. nepříznivá progn. del(13)(q14) gen RB1 tumor-supresor, dobrá progn. (samost.) del p53 17p13 tumor-supresor, špatná progn., kratší přežití, B-CLL nezávislý faktor přestavby 11q B-CLL: nízká proliferační aktivita používané metody FISH a CGH

Solidní nádory dětského věku Spolupráce s Odd. dětské onkologie FN Brno vyšetřovaný materiál: kostní dřeň otisky tumorů parafinové bločky kultivovaná tkáň TU

Nejčastější typy nádorů Materiál z KDO FN Brno Neuroblastom rhabdomyosarkom (RMS) lymfomy ( HL, NHL) Ewing. sarkom

Neuroblastom Nálezy: Nmyc amplifikace 2p24 (10% TU) del(1)(p36) zmnožení 17q (gain 17) dobrá prognoza polyploidie: 3n, 5n, 6n aneuploidie: zmnožení 6, 7, 17 nebo ztráta 11,14, X - špatná prognoza 2n, 4n, del 1p36, del 11q, dup 17q21-qter

Rhabdomyosarkom RMS RMS 5-8% dětských malignit: embryonální E-RMS x alveolární A-RMS A-RMS t(2;13)(q35;q14) t(1;13)(p36;q14) E-RMS: hyperdiploidie (2, 7, 8, 12, 13, 17, 18, 19) hypodiploidie - monosomie: 10, 14, 15, 16

Ewingův sarkom t(11;22)(q24;q12) FLI 1/EWSR 1 90% ESWR 1 22q12 t(21;22)(q21;q12) ERG /EWSR 1 t(7;22)(p22;q12) ETV1/EWSR 1 t(17;22)(q12;q12) E1AF/EWSR 1 stanovení mol. gen.metodami maligní melanom t(12;22)

Maligní lymfomy NHL x HL, heterogenní skupina NHL - chromos. změny až 90%, nevznikají fuzní geny, mění se exprese protoonkogenů del13q14 RB1 tumor-supresor t(11;14) Mantle cell lymfom 11q13 gen BCL-1 t(8;14), t(8;22), t(2;8) Burkit.ly. 8q24 c-myc přestavba 18q21(BCL-2) nejčastější t(14;18) folikulární ly. 3q27(BCL-6) t(3;14), t(3;22), t(3;4), t(3;6) anaplastický velkobuněčný u dětí t(2;5) 30-50%

Hodgkinův lymfom Nízká úspěšnost kultivace, nízká frekvence mitoz cyto: nálezy cytogenetických změn variabilní 20 - 80% hyperdiploidie strukturní změny: 1p, 1q, 2q, 6q, 11p, 11q, 14q změny komplexní, prognoza nepříznivá

Závěr Specifické nálezy a metody jejich detekce: Typické geny - mol. gen. metody onkogeny, tumor supresorové geny typické chromoz. aberace - cytogenetika fuzní geny(chimerické proteiny), poziční efekt-aktivace protoonkogenů sekundární změny - cytogenetika (komplexní změny, kryptické translokace)