Real-time PCR v diagnostice MRD a vývoji metastáz u neuroblastomu Kadlecová J.1, Kratochvílová A. 1, Ravčuková B 1 , Valášková I. 1, Gaillyová R. 1 a Štěrba J2. 1 Oddělení lékařské genetiky, 2 oddělení dětské onkologie FN Brno
Neuroblastom Nádor periferního nervového systému Patří mezi nejčastější dětské solidní tumory 8-10% všech pediatrických nádorových onemocnění 40% případů diagnostikováno do 12ti měsíců a 90% do 5ti let věku pacienta Incidence 5-10 nemocných na jeden milion dětí Odvozený od migrujících primitivních buněk neurální lišty autonomního nervového systému Primární ložiska: dřeň nadledvinek, ganglia sympatiku U >50% pacientů v době stanovení diagnosy zjištěny metastáze do ostatních orgánů (časně metastázující) O molekulárním mechanismu růstu, diferenciace a programované smrti NBL je stále velmi málo informací
Klinická stádia neuroblastomu Klasifikace podle Evanse (Children´s Cancer Study Group Staging System for Neuroblastoma) Stadium I Stadium II Stadium III Stadium IV Stadium IV-S -Ložisko nádoru je vymezeno orgánem,ve kterém nádor vznikl -Nádor se rozšiřuje mimo původní ložisko, ale nepřekračuje střední linii. Mohou být zasaženy regionální lymfatické uzliny v blízkosti nádoru. -Nádor se celkově rozšiřuje za střední linii, jsou zasaženy lymfatické uzliny na obou stranách těla. -Nádor metastázuje do vzdálených orgánů (lymfatické uzliny, kosti a kostní dřeň, játra, kůže). -Zahrnuje stádia I a II u dětí mladších 12 měsíců,s metastázemi v játrech, kůži, kostní dřeni, ale kosti nejsou zasaženy.
Prognostické faktory Věk Stadium choroby při diagnose Histopatologický nález Hladiny biochemických markerů v krvi a moči: k.vanilylmandlová a homovanilinová, ferritin, neurospecifická enoláza, laktátdehydrogenáza, katecholamin a jeho deriváty Genetické faktory ploidie buňky, stupeň amplifikace N-myc protoonkogenuHSRs, delece 1p36(obsahuje gen pro nádorový supresor)LOH, dmins, úroveň exprese genu pro TH, TRK A a C, GD2 syntetázy, telomerázová aktivita....
Genová exprese v buňkách neuroblastomu molekulární markery Rozdílná genová exprese průběh nemoci příznivý vs. nepříznivý neuroblastom vs. normální tkáň Tkáňově specifická exprese gen TH GD2 syntetáza Nádorově specifická exprese geny MAGE, GAGE Trk A Trk C n-myc Trk B n-myc telomerázová aktivita (hTERT) telomerázová aktivita (hTERT) Změna úrovně exprese
Klinický význam molekulárních markerů stanovení diagnósy sledování průběhu onemocnění (MRD, relaps) detekci NB buňěk v transplantátu před autologní transplantací určení prognósy
Tyrosinhydroxyláza (TH) Stanovení citlivosti detekce TH mRNA fragmentační analýza (ABI PRISM 310) 10-3 bb NB 10-4 bb NB 10-5 bb NB 10-6 bb NB 1.enzym dráhy syntézy katecholaminů katecholaminy důležité neurotransmitery a hormony, regulují vnitřní funkce a motorickou koordinaci jsou sekretovány 98% NB (NB je endokrinně aktivní ) jejich metabolity používány pro sledování průběhu onemocnění exprese TH genu je regulována tkáňově specificky během neonatálního vývoje a diferenciace - lokalizace genu TH v oblasti 11p15.5 MG TH 299bp Stanovení citlivosti detekce mRNA pro TH 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2
MAGE 1- 6 a GAGE 1-8 Strategie detekce exprese genů MAGE a GAGE izolace RNA RT-PCR kontrola kvality bMG detekce jednotlivých subtypů MAGE 1-6/ GAGE 1-8 Genové rodiny Kódují nádorové antigeny Jejich produkty (vázané na MHC) jsou rozpoznávány cytotoxickými T lymfocyty Exprimovány širokým spektrem lidských nádorů (NB, melanom, k.plic, žaludku, prsu...) M 1-6 1 2 3 4 5 6 K- 1,5 % agarózový gel, barveno EtBr
Detekce exprese MAGE1-6/ GAGE1-8 pomocí real-time PCR K-/genomDNA Real-time PCR : pomocí FRED sond ( fluorescence resonance energy transfer): Hybrid. proba 1: donor (fluorescein) Hybrid proba 2: akceptor (LC RED640, 750) Analýza bodu tání amplifikovaného produktu je přímo závislá na sekvenci analyzovaného produktu MAGE h-2M Relativní kvantifikace pomocí LightCycleru.(Roche) Koncentrace cílové sekvence (MAGE) je vyjádřena ve vztahu k referenčnímu (housekeeping) genu (beta2-Mikroglobulin). K výpočtu koncentrace cílové sekvence i refernečního genu analyzovaného vzorku je užívána standardní kalibrační křivka.
Neurotrofinové receptory trk A, B a C neurotrofiny a jejich receptory regulují proliferaci, diferenciaci a smrt normálních i neoplastických buněk nervové tkáně tyrosin-kinázové membránové receptory trk A, B, C jsou nezbytné pro vysokou vazebnou afinitu a plnou biologickou funkci neurotrofinů a hrají důležitou roli v biologii a klinickém chování neuroblastomů vazebný ligand pro trk A receptor je NGF (nerve growth factor), pro trk B receptor : BDNF (brain derived nerotrophic factor, pro trk C receptor : NT-3 (neurotrophin 3)
Kvantitativní stanovení transkriptu genu trk A pomocí real-time PCR h-2M Relativní kvantifikace. Koncentrace cílové sekvence (trk A) je vyjádřena v poměru ke koncentraci referenčního (housekeeping ) genu , např. 2M (2-Microglobulin gene) . K výpočtu koncentrací je užívána standardní kalibrační křivka.
Telomerázová aktivita (TA) Telomeráza multiproteinový komplex lidská telomerázová reversní transkriptáza (hTERT) vnitřní RNA řetězec (hTR) RNA vazebný protein (hTEP1) podíl na vývoji a progresi maligních nádorů TA je detekována v obnovujících se a rychle se dělících buňkách (zárodečné a nádorové buňky) může být zachycena v hyperplastických a jiných než neoplastických tkáních marker proliferace prognostický marker neuroblastických nádorů, vysoká TA (exprese hTERT) koreluje s agresivním biologickým chováním
GD2 syntetáza téměř všechny tkáně neuroblastomu vysokou úroveň GD2 gangliosidu normální buňky (ne neurálního původu) minimální nebo nulová hladina GD2 gangliosidu GD2 syntetáza (-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferáza) klíčová role v biosyntéze GD2 gangliosidu aktivita koreluje s expresí GD2 na povrchu buněk senzitivní a specifický molekulární marker pro detekci buněk odvozených od neurální lišty
Závěr Je možno postihnout heterogenitu NB zvýší Zavedení vysoce citlivé metody real-time PCR k detekci i ke kvantifikaci nádorových markerů umožňuje odhad rizika vývoje metastáz v čase diagnózy nemoci prognózu léčebné odpovědi testování kmenových buněk před autologní transplantací kombinací více molekulárních markerů s dalšími nezávislými metodami detekce ( imunocytologickými, histologickými) je možno zvýšit detekční možnosti nádorové diagnostiky. Je možno postihnout heterogenitu NB zvýší se pravděpodobnost záchytu NB
za laskavé poskytnutí buněčné linie neuroblastomu IMR-32 Poděkování patří především spolupracovnicím z laboratoře molekulární genetiky OLG Brno a také Dr. S. A Burchill z oddělení dětské onkologie,St.James´s University Hospital, Leeds za laskavé poskytnutí buněčné linie neuroblastomu IMR-32