Nemoci způsobené patologickou konformací proteinů Jan ILLNER Alice Skoumalová

Nemoci Proteiny Alzheimerova choroba Amyloid-β Parkinsonova choroba α-Synuclein Diabetes mellitus typ II. Amylin Amyotrofická laterální skleróza Superoxid dismutáza Cystická fibróza Cystická fibróza transmembránový regulátor (chloridový kanál) Srpkovitá anémie Hemoglobin Hungtingtonova choroba Huntingtin Creutzfeldt-Jakobova nemoc Prion protein Amyloidózy 10 různých proteinů

Teoretický model zavinování (hierarchický): tvorba lokálních sekundárních struktur tvorba terciálních struktur (subdomény, domény) stabilní konformace Termodynamický model: Protein se zavinuje tak, aby byla co nejmenší jeho volná energie: nativní stav Existuje však několik alternativních konformací: různé funkce proteinu patologický protein

Neurodegenerativní choroby Abnormální terciální struktura specifického proteinu způsobí patologickou konformaci α-helix β-skládaný list Normální protein (nativní struktura) Protein způsobující onemocnění (patologická konformace) konformační změna Agregace Toxická aktivita Neurodegenerativní choroby Ztráta funkce

Protein s patologickou konformací Mutace (familiární) Chyba v procesu skládání (sporadické) Rozpoznání Degradace (systém kontroly kvality proteinů) 1. Chaperony 2. Systém ubikvitin proteasom

Molekulární chaperony Hsp 70 - nově syntetizované proteiny: (heat shock protein) Chaperoniny - špatně zavinuté proteiny: Hsp 60 Pomáhají získat proteinům 3D strukturu, Chrání před vznikem patologických konformací. Rozpoznávají patologický protein, vážou se na hydrofobní povrch a inhibují agregaci. Patří se hlavně tzv. heat shock proteiny (vznikající při tepelném poškození)-chrání před denaturací.

Ukládání (Amyloidózy) Toxická bílkovina (Alzheimerova choroba) Ubikvitin Ribosom RNA ATP Chaperony Nativní protein Protein s patologickou konformací Agregát/fibrilární amyloid Chaperony Proteasom Ukládání (Amyloidózy) Degradovaný protein Toxická bílkovina (Alzheimerova choroba) Ztráta funkce (Cystická fibróza)

Důsledky patologické konformace proteinů: Vznik toxické bílkoviny neurodegenerativní onemocnění - chronické, progresivní onemocnění ztráta neuronů kumulace patologických proteinů vznik agregátů (Alzheimerova, Parkinsonova, Hungtingtonova choroba) Ztráta funkce cystická fibróza - mutace genu pro chloridový kanál Ukládání amyloidózy - fibrily nejsou toxické, ale nerozpustné ukládání způsobuje poškození tkání

Struktura amyloidních fibril rovné, nerozvětvené, velikost 8-16 nm složeny ze 2 až 6 protofilament (3-4 nm) bohaté na β-struktury (řetězec β-skládaného listu je kolmý na osu fibrilu, vzájemně jsou spojeny vodíkovými můstky)

Molekulární faktory tvorby amyloidu patologická konformace proteinu je klíčová pro tvorbu amyloidu stabilita proteinu (stálost nativní konformace proti abnormální) je důležitý faktor pro náchylnost k tvorbě amyloidu Destabilizační faktory: 1. Extrémní podmínky prostředí (např. kyselé buněčné kompartmenty) 2. Proteolytické štěpení proteinů (endogenní proteázy) 3. Mutace, které pozmění primární strukturu (mnoho amyloidóz má familiární formu způsobenou mutací proteinovém prekursoru amyloidu) 4. Kontakt s lipidovou dvojvrstvou membrán (Aβ)

Tvorba amyloidu Tvorba amyloidu (in vitro): 1. Lag fáze (nukleace). Hodiny až dny, zkrácena přidáním malého množství fibrilu (nukleační jádro). 2. Fáze růstu: Prodlužování fibril. Není zcela jasné, jak je iniciována tvorba amyloidních fibrilů in vivo (pravděpodobně jsou zapojeny i jiné molekuly). Monomerní protein-Malý globulární agregát-Krátké filamenta-Nerozvětvené fibrily- Fibrilární shluky.

Kontrola kvality proteinů Chaperony a proteasy fungují spolu a určují osud proteinů v buňce (kontrola kvality proteinů). Určují, zda jsou proteiny reaktivovány či degradovány a v případě poruchy této kontroly dochází k agregaci!

Alzheimerova choroba

Léčba: nemoc nelze zastavit, pouze zpomalit včasná diagnostika Charakterizace: progresivní neurodegenerativní onemocnění nejčastější forma demence spojená se stářím celkový pokles kognitivních funkcí afektivní poruchy a poruchy chování Diagnóza: histologické vyšetření mozkové tkáně (senilní plaky, neurofibrilární tangly) klinická kritéria: neuropsychologické vyšetření zobrazovací metody laboratorní testy problematická diagnostika: symptomy společné pro další demence nebo se překrývají s projevy stárnutí Léčba: nemoc nelze zastavit, pouze zpomalit včasná diagnostika Příčina: nejasná; ukládání β-amyloidního peptidu, oxidační stres ??? Cíle výzkumu: vyvinout laboratorní testy (např. z krve nebo mozkomíšního moku), které by umožnily lepší diagnostiku

Typy a prevalence ACH v populaci sporadická familiární většina pozdější nástup neznámé příčiny méně než 2 % nástup před 65. rokem

Patologické znaky ACH Amyloidní (senilní) plaky Neurofibrilární tangly: složeny z agregovaného a hyperfosforylovaného proteinu tau. Normální tau protein asociuje s tubulinem a vytváří mikrotubuly (tvar a struktury buňky, nitrobuněčný transport). Hyperfosforylace tau proteinu vede k disociaci s tubulinem a poruše buněčných funkcí, even. buněčné smrti. Stupeň fosforylace tau proteinu je dán aktivitou proteinkináz a fosfatáz. U AD hyperfosforylovaný tau protein agreguje intracelulárně. Amyloidní plaky: složeny z fibril amyloidu β, nachází se extracelulárně, ale původ intracelulární (neurony sekretují rozpustný peptid Aβ). První histopatologický znak AD. Plaky obsahují hlavně Aβ42, který vzniká v důsledku abnormálního zpracování APP (amyloid prekurzor protein). Amyloidní (senilní) plaky fibrily β-amyloidního proteinu (Aβ) abnormální zpracování APP (amyloidový prekurzorový protein) Neurofibrilární tangly (klubka) helikální filamenta tvořená z hyperfosforylovaného tau proteinu

Úloha amyloidu β v patogenezi ACH Snaha při výzkumu: snížit hromadění Aβ42 inhibicí β- nebo γ-sekretáz, podporou α-sekretázy nebo zvýšení odstraňování Aβ42 pomocí specifických protilátek

Jednotlivá stádia ACH Preklinická fáze: pouze mírné často přehlédnutelné příznaky zapomínání nedávných událostí, časová a prostorová dezorientace, ztráta iniciativy Časná (prodromální) fáze: výraznější příznaky, nemocný nedokáže vykonávat řadu běžných každodenních aktivit výrazné výpadky paměti, snížená schopnost postarat se sám o sebe bez pomoci, zhoršení řeči, nemocný se ztratí na známých místech Stádium demence: úplná závislost, kognitivní poruchy ústí v rozklad celé osobnosti obtíže při příjmu potravy, neschopnost poznat členy vlastní rodiny, obtížná chůze, neudržení moči a/nebo stolice

Úloha oxidačního stresu v patogenezi ACH patologické změny v mozku oxidační stres

Priony a prionová onemocnění

Definice prionů Priony jsou proteinové přenosné patogeny způsobující některé fatální neurodegenerativní choroby Creutzfeld-Jakobova nemoc kuru bovinní spongioformní encefalopatie Prion je zkratka pro proteinaceous infectious particle (analogie virion) Jde o infekční agens, které nenese genetickou informaci uloženou v nukleové kyselině! Priony jsou proteiny s patologickou konformací, které jsou schopny dále propagovat konformační změny nativních proteinů na abnormální struktury

PrPC PrPSc Název PrPC (cellular) Normální protein Transmembránový glykoprotein (neurony, lymfocyty); funkce není známá; váže Cu2+ Dominantní struktura α-helix Dobře rozpustný ve vodě Monomerní, snadno štěpen proteázami Kódován genem zvaným PRNP na chromosomu 20 PrPSc Název PrPSc (scrapie) Abnormální protein způsobující nemoc Stejná sekvence aminokyselin (primární struktura) Dominantní struktura β-skládaný list Nerozpustný ve vodě Multimerní, rezistentní k působení proteáz Když je v kontaktu s normálním proteinem PrPC, konvertuje ho na abnormální PrPSc Tvoří agregáty (způsobují onemocnění a/nebo vznikají jako vedlejší efekt) Prionový protein PrP je normální membránový protein nacházející se v těle. Nemoc je způsobena jeho isoformou s abnormální konformací.

Molekulární model struktury: PrPC PrPSc Převažuje α-helix (3x) β-skládaný list (40%), α-helix (30%)

Prionové agregáty

Prionové choroby: vzácná neurodegenerativní onemocnění sporadické familiární přenosné u starších lidí rychlá progrese CJD vrozené mutace PrPC genu na patologický PrPSc velmi vzácné mediálně známé BSE, kuru Creutzfeldt-Jakobova choroba nejčastější prionové onemocnění smrt přichází do 1 roku neléčitelná choroba Kuru („roztřesený zimou a horečkou“) prionové onemocnění mezi domorodci na Nové Guinei kanibalismus: pojídání mozků mrtvých

Přenos prionů Přímý kontakt s infikovanou tkání Konsumpce infekčního masa z instrumentů mozkové chirurgie rohovkové transplantáty elektrodové implantáty kanibalismus, nemoc kuru požití masa z krav s BSE, vCJD Mechanismus přenosu prionů z trávicího traktu do mozku není znám! Hypotéza: Proteiny nejsou tráveny (rezistence k proteázám), ale jsou transportovány přes lymfatickou tkáň střeva (gut-associated lymphoid tissue)