Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody (KBC/BAM) Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc.

Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu, množství a charakter analyzovaného proteinu, přítomnosti interferujících látek a požadavkem na přesnost. Např. Lowryho metoda je velmi citlivá, ale na druhé straně je dvoustupňová a vyžaduje minimální dobu inkubace 40 min. Metoda dle Bradfordové je mnohem citlivější a výsledek můžeme znát již za 5 minut, avšak pro proteiny s velmi nízkým obsahem argininu je nepoužitelná. Problém odhadu obsahu a charakteru proteinů je v tom, že jako standard používáme čistý protein, ale analyzujeme obvykle směs, nebo protein o neznámém aminokyselinovém složení. Kriteria budou diskutována u jednotlivých metod. Literatura pro podrobnější studium: Stoscheck, C.M. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Velmi důležitá analýza bez drahých instrumentů. Dnes se preferují spektrofotometrické metody, stanovení dusíku (po mineralizaci) při Kjeldahlově metodě, nebo gravimetrie a refraktometrie již patří minulosti. 1. Biuretová metoda; reakce peptidové vazby s Cu(II) v alkalickém prostředí. Tvoří se modrofialové zbarvení, lmax = 540 nm. Činidlo obsahuje CuSO4, vínan sodno-draselný a NaOH. Nutný standard (BSA, ovalbumin), metoda nezávisí na aminokyselinovém složení, ale je málo citlivá (cca 10 - 100 mg/mL). Ruší např. NH4+, Tris. 2. Lowryho metoda, od roku 1951, modif. 1972, citlivost 1 mg/mL, jedna z nejcitovanějších prací (viz obr.). Citlivost biuretové metody zvýšena přídavkem Folin-Ciocalteauova fenolového činidla.

biuret  Lowry

Lowryho metoda mnohem více závisí na složení proteinu Lowryho metoda mnohem více závisí na složení proteinu. K reakci peptidové vazby s Cu2+ přispívá redukce fosfomolybdenanů a fosfowolframanů tyrosinem (ale i tryptofanem a cysteinem). Principem je nejprve provedení biuretové reakce a pak přídavek Folinova činidla. Měří se při 650 nm (750 nm), široká absorpce, pro kalibraci nutné standardy (BSA, OVA). Vyšší citlivost než biuretová reakce (2-100 mg/mL), zbarvení však není v čase stabilní. Ruší např. NH4+. 3. BCA metoda; od 1985, citlivost 0, 5 mg/ml, využívá sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA), která komplexuje ionty Cu(I) tvořené reakcí peptidové vazby s Cu(II). Činidlo se připravuje smísením roztoků sodné soli BCA v alkalickém prostředí (100 dílů) a CuSO4 (1 díl). Měří se při 562 nm, citlivost na úrovni Lowryho metody, menší interference (NH4+ ano). Kalibrace na standardy (BSA).

BCA method Colorimetric method; read at 562 nm Compatible with most ionic and nonionic detergents Faster and easier than the Lowry method All reagents stable at room temperature for 2 years Working reagent stable for 24 hours Linear working range for BSA from 20-2,000 µg/ml Minimum detection level of 5 µg/ml with the enhanced protocol Adaptable to microplates Less protein-to-protein variation than dye-binding methods Applications: Studying protein:protein interactions Measuring column fractions after affinity chromatography Estimating percent recovery of membrane proteins from cell extracts High-throughput screening of fusion proteins

Reaction schematic for the bicinchoninic acid (BCA)-containing protein assay.

Time comparison of BCA Protein Assay Reagent vs. Lowry Protein Assay BCA Protein Assay Reagent 1. Mix reagents 1 minute 2. Add sample and incubate 30 minutes 3. Read at 562 nm 1 minute Total BCA Time: 32 minutes Lowry Protein Assay 1. Make reagents 70 minutes 2. Add sample and incubate 20 minutes 3. Add Folin Reagent 1 minute 4. Incubate 30 minutes 5. Read at 750 nm 1 minute Total Lowry Time: 122 minutes

4. Metoda Bradfordové; principem je adsorpční vazba barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 na molekulu proteinu. Citlivost 1 mg/mL. Závisí na obsahu bazických (zvl. Arg), ale i aromatických aminokyselin. Metoda je velmi populární, protože je rychlá (5 min), množství látek však interferuje, negativně zejména detergenty (SDS, Triton). Nedává tedy tak spolehlivé výsledky jako obdobně citlivá BCA metoda, kde tyto látky neruší. Citlivost je 5 x vyšší než u Lowyho metody, lineární kalibrace max. po 20 mg proteinu. Činidlo (vodný roztok) obsahuje barvivo, ethanol a H3PO4. Barva hnědá, po reakci s proteinem intenzivně modrá, lmax = 595 nm. Všechny dosud zmíněné metody jsou destruktivní, vzorek je pro další analýzu nepoužitelný!

Detects protein concentrations from 1-1,5 µg/ml This high performance Bradford reagent exhibits substantially increased linearity of response, and only half the expected protein-to-protein variation of other commercial Bradford protein assays. Detects protein concentrations from 1-1,5 µg/ml Ready-to-use dye-binding reagent formulation Fast (almost immediate) color development; read at 595 nm Compatible with reducing sugars, reducing substances and thiols (Table 1.) Refrigerated reagent is stable for 2 years Superior linear response over the range of 125-1,500 µg/ml Adaptable to microplates Micro protocol useful for protein concentrations from 1-25 µg/ml

Use of Coomassie G-250 Dye in a colorimetric reagent for the detection and quantitation of total protein was first described by Dr. Marion Bradford in 1976. In the acidic environment of the reagent, protein binds to the coomassie dye. This results in a spectral shift from the reddish/brown form of the dye (absorbance maximum at 465 nm) to the blue form of the dye (absorbance maximum at 610 nm) (Figure 1). The difference between the two forms of the dye is greatest at 595 nm, so that is the optimal wavelength to measure the blue color from the coomassie dye-protein complex. If desired, the blue color can be measured at any wavelength between 575 nm and 615 nm. At the two extremes (575 nm and 615 nm) there is a loss of about 10% in the measured amount of color (absorbance) compared to that obtained at 595 nm.

Development of color in coomassie dye-based (Bradford) protein assays has been associated with the presence of certain basic amino acids (primarily arginine, lysine and histidine) in the protein. Van der Waals forces and hydrophobic interactions also participate in the binding of the dye by protein. The number of Coomassie dye ligands bound to each protein molecule is approximately proportional to the number of positive charges found on the protein. Free amino acids, peptides and low molecular weight proteins do not produce color with coomassie dye reagents. In general, the mass of a peptide or protein must be at least 3,000 daltons to be assayed with this reagent. The assay is performed at room temperature and no special equipment is required. Simply add the sample to the tube containing reagent and the resultant blue color is measured at 595 nm following a short room-temperature incubation. The coomassie dye containing protein assay is compatible with most salts, solvents, buffers, thiols, reducing substances and metal chelating agents encountered in protein samples.

Nevýhoda The main disadvantage of coomassie-based (Bradford) protein assay is its incompatibility with surfactants at concentrations routinely used to solubilize membrane proteins. In general, the presence of a surfactant in the sample, even at low concentrations, causes precipitation of the reagent. Since the coomassie dye reagent is highly acidic, a small number of proteins cannot be assayed with this reagent due to their poor solubility in the acidic reagent. Also, coomassie reagents result in about twice as much protein:protein variation as copper chelation based assay reagents. In addition, coomassie dye stains the glass or quartz cuvettes used to hold the solution in the spectrophotometer while the color intensity is being measured. (Cuvettes can be cleaned with strong detergent solutions and/or methanol washes, but use of disposable polystyrene cuvettes eliminates the need to clean cuvettes.)

Typical color response curves for BSA and BGG using the Coomassie Plus – The Better Bradford Assay Reagent (BGG=bovine gamma globulin) .

Linearita Bradfordové metody The Better Bradford Assay is linear from 125 to 1,000 µg/ml. When using bovine gamma globulin (BGG) as the standard, the Coomassie Plus – The Better Bradford Assay is linear from 125 to 1,500 µg/ml.

Coomassie Dry Protein Assay Plates

5. Přímá spektrofotometrická stanovení (UV oblast); díky přítomnosti chromoforů v molekulách proteinů, které absorbují v UV oblasti spektra. Velkou výhodou je, že jde o nedestruktivní metodu. Pracuje se s křemennými kyvetami, nikoli sklo ani plast. V blízké UV oblasti (280 nm) není velká citlivost – 50 mg / mL, v daleké UV oblasti (205 nm) pak dochází ke značné interferenci. Samozřejmě je zde velká závislost na aminokyselinovém složení proteinu. Vzhledem k tomu, že UV absorpce je dána aromatickými AK (hlavně Trp a Tyr), je nutná jejich přítomnost. Interference širokého absorpčního pásu nukleových kyselin (lmax = 260 nm) se eliminuje měřením při dvou vlnových délkách a početní korekcí. V daleké UV oblasti se využívá vlnová délka 205 nm (maximum absorpce peptidové vazby je při 192 nm).

Vlnová délka (nm) Molární absorpce

Při měření v daleké UV oblasti je nutno precizně volit pufr (aby neabsorboval), vzorky by měly být zbaveny malých částic (a tím i opalescence) centrifugací, pokud možno bez velkého obsahu O2. Vzorce pro přímé UV stanovení: c (mg/mL) = 1.55 A280 - 0.76 A260 c (mg/mL) = (A235 - A280)/2.51 c (mg/mL) = (A224 - A233)/5.01 c (mg/mL) = A205 [27 + 120 (A280/A205)] 6. Edelhochova metoda; při znalosti aminokyselinového složení je možné spočíst extinkční koeficient proteinu e280. Podmínkou je přítomnost tryptofanu nebo tyrosinu v molekule. e280 = nTrp.5500 + nTyr.1490 + nCys.125 (M-1.cm-1)

7. Fluorescenční stanovení; fluorimetrické stanovení proteinů je založeno na reakci primárních aminoskupin v proteinu (Lys, N-koncová aminoskupina) s o-ftalaldehydem. Citlivost metody může být zvýšena hydrolýzou proteinů před měřením. Ruší pufry s obsahem primárních aminoskupin (Tris), nejlépe použít borátový pufr, pH 10.4. Měří se po přídavku hydroxidu sodného, excitační vlnová délka 340 nm, emise mezi 440 a 455 nm. Každý vzorek se měří pouze jednou, ozáření snižuje intenzitu fluorescence.

Protocol for Quantiation of Proteins using NanoOrange™ Protein concentrations as low as 10 ng/mL can be measured. This level of sensitivity is much superior to spectrophotometric techniques such as the BCA method (0.5 µg/mL), the Bradford assay (1 µg/mL), the Lowry assay (1 µg/mL), or 280 nm absorbance (50 µg/mL). (1-4)The NanoOrange™ assay also shows less protein-to-protein variability than the Bradford assay.

Protocol for Quantiation of Proteins using NanoOrange™ Invitrogen. To perform a protein assay, the protein sample is simply added to the NanoOrange™ reagent in a specialized diluent and this mixture is heated at 95° C for ten minutes. Fluorescence can be measured as soon as the mixture has cooled to room temperature. Alternatively, samples can be read up to six hours after preparation with no loss in sensitivity, as long as samples are protected from light. The NanoOrange™ reagent is virtually nonfluorescent in aqueous solution, becoming strongly fluorescent at about 570—590 nm upon interaction with proteins, when excited at about 470—490 nm. Detection of the fluorescence using the TD-700 fluorometer equipped with a fluorescein filter kit allows protein concentrations from 10 ng/mL to 10 µg/mL to be accurately measured relative to a standard curve

Full-range calibration plot for bovine serum albumin (BSA) using the TD-700 Fluorometer and the NanoOrange™ Protein Quantitation Kit.

Low-range calibration plot for bovine serum albumin (BSA) using the TD-700 Fluorometer and the NanoOrange™ Protein Quantitation Kit.

Stanovení proteinů (Protein quantitation) Absorpce při 280 nm (semi-kvantitativní) Absorpce způsobená tryptofanovými (tyrosinovými) zbytky. Výhoda: rychlá, nedestruktivní Nevýhody: - ruší látky s absorpcí při 280 nm - různá absorpce různých proteinů z důvodu různých obsahů Trp Výpočet: A280 = 1 odpovídá 0.5 – 2 mg.ml-1 proteinu Kolorimetrické metody (Mikro-)biuretová metoda: Komplex Cu2+ s peptidovými vazbami (-CO-NH-) v alkalickém prostředí  Cu+-protein komplex, absorbance při 570 nm Lowry stanovení: Přenos elektronů z navázaných měďnatých iontů a z aromatických vedlejších skupin na Folinovo činidlo Stanovení dle Bradfordové: Adsorpce Coomassie Brilliant Blue G250 na protein (hlavně Arg, ale také His, Lys, Trp, Tyr a Phe vedlejší řetězce) Stanovení s bicinchoninovou kyselinou: chelatace měďného iontu s BCA

Srovnání nejběžnějších metod stanovení proteinů