Základy histochemie, imunohistochemie a elektronmikroskopické techniky. Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241

Histochemie Histochemická metoda – prokazuje chemickou látku či enzymovou aktivitu vázanou na určitou strukturu na histologickém řezu Prokazované látky nesmějí difundovat z místa, kde se nacházejí. Produkt musí být nerozpustný, barevný (světelný mikroskop) nebo elektrondenzní (elektronový mikroskop). Metoda by měla být specifická pro chemickou látku či skupinu. Procedura nesmí denaturovat nebo blokovat reaktivní skupiny. Histochemie: Stavební: průkaz chemických látek v buňkách a tkáních (průkaz lipidů, polysacharidů, glykosaminoglykanů, fosfolipidů, železa, vápníku ad.) Katalytická (enzymová): prokazuje aktuální štěpení substrátu enzymem 2

Průkaz nukleových kyselin DNA – Feulgenova reakce Hydrolýza DNA kys. chlorovodíkovou, odštěpení purinových bází od monosacharidu, odhalení aldehydových skupin na deoxyribóze, jejich reakce se Schiffovým činidlem, vznik nerozpustné červenofialové substance. Jaderný chromatin se barví červenofialově (pozitivní reakce na DNA), jadérko zůstane nezbarveno (RNA). Vyšetření sex-chromatinu RNA Barví se bazickými barvivy: toluidinovou modří, metylenovou modří Nutnost kontrolního řezu inkubovaného v ribonukleáze. Struktura, která po inkubaci ztratí svoji bazofilii, obsahuje RNA. 3

Průkaz lipidů Průkaz lipidů olejovou červení, kůra nadledviny Nelze zalévat do parafínu, nesmí přijít do styku s organickými rozpouštědly (benzen, xylen)! Fixace: Bakerova tekutina, zmrazení, event. se zalévá do želatiny nebo celodalu. Krájí se v kryostatu. Barvení barvivy rozpustnými v tucích: Sudan III, IV, olejová červeň – barví červeně, sudanová čerň – barví modročerně až černě Jádra se dobarvují hematoxylinem nebo jádrovou červení (kontrastně k tuku). Montujeme do media rozpustného ve vodě (glycerin, glycerinová želatina). Základní orientační metoda. 4

Průkaz fosfolipidů Luxolová modř, jádrová červeň, mozek Fosfolipidy – barvíme luxolovou modří, používáme ke znázornění myelinové pochvy nervových vláken Šedá hmota Bílá hmota (myelinizovaná nervová vlákna) Mikrofotografie: doc. Vernerová 5

Průkaz polysacharidů – PAS reakce PAS = zkratka složená z počátečních písmen názvů použitých reagencií (Periodic Acid a Schiffovo reagens) Princip reakce spočívá v oxidaci glykolových skupin cukru kyselinou jodistou na aldehydové skupiny, ty reagují se Schiffovým činidlem za vzniku červenofialové nerozpustné sraženiny. PAS pozitivní: glykogen, retikulární vlákna, hlen, bazální membrány, mezibuněčná hmota hyalinní chrupavky Bazální membrána Retikulární vlákna Hlen M. Jirkovská, Histologická technika, 2006 PAS reakce, hematoxylin, žlučník

Průkaz glykogenu PAS reakce s diastázovým (amylázovým) testem odliší glykogen od jiných polysacharidů (diastáza = enzym štěpící glykogen) Provedení: První řez se vzorkem je ponechán v destilované vodě, druhý řez (kontrola) je inkubován s enzymem diastázou (amylázou), po vyprání je na obou řezech provedena PAS reakce. Kontrolní řez PAS negativní, vzorek PAS pozitivní  je glykogen Kontrolní řez PAS pozitivní, vzorek PAS pozitivní  jde o PAS pozitivní, ale diastázorezistentní polysacharid Řez bez diastázy - vzorek Řez s diastázou - kontrola PAS + jiný polysacharid, diastázorezistentní - glykogen polysacharid není přítomen 7

PAS reakce (jádra dobarvena hematoxylinem) PAS+ glykokalyx enterocytů (šipka), hlen pohárkových buněk (x) Průkaz glykogenu v hepatocytech (PAS reakce, hematoxylin) trámčitý epitel - játra x x

Průkaz glykosaminoglykanů (GAG) Barvení alciánovou modří Metachromatická reakce (barvení toluidinovou modří) Výskyt: hlen (epitel žlučníku, pohárkové buňky epitelu střeva, mucinózní buňky), mezibuněčná hmota pojiv, granula heparinocytů Alciánová modř, jádrová červeň Průkaz kyselých mukopolysacharidů v hlenu epitelu žlučníku Alciánová modř, jádrová červeň, hyalinní chrupavka

Průkaz GAG alciánová modř, jádrová červeň, pohárkové buňky epitelu střeva

Katalytická histochemie Enzymy – katalyzátory biochemických reakcí Aktivita enzymů je závislá na řadě faktorů – teplota a pH. Možnost použití aktivátorů, např. kationty hořčíku, manganu ad. Zpracování tkáně co nejdříve po odběru, většina enzymů nesnese fixaci. Katalytická histochemie prokazuje aktivitu enzymu (štěpení substrátu enzymem). Princip - histochemická reakce: enzym substrát  reakční produkt Další reakce vizualizuje reakční produkt: např. azokopulace, tetrazoliová metoda, peroxidázová reakce, precipitace s kationty kovů Nutnost kontrolních řezů – doložení specifity průkazu. 11

Azokopulační metoda Průkaz aktivity alkalické fosfatázy Inkubační roztok: substrát ( naftylfosfát), stabilizovaná diazoniová sůl (Fast Red TR), pufr pH 9. Princip metody: Enzym štěpí substrát a uvolněný naftylový zbytek se naváže na diazoniovou sůl za vzniku nerozpustné barevné sraženiny azobarviva. Ledvina Ledvinová tělíska Výsledek: přítomnost alkalické fosfatázy - barevná hnědočervená sraženina (zbarvení podle použité diazoniové soli). Množství azobarviva je přímo úměrné aktivitě enzymu a je lokalizováno v místě, kde byl enzym. Alkalická fosfatáza – žíhaný lem resorpčního epitelu proximálních tubulů ledvin Proximální tubuly

Průkaz kyselé fosfatázy (marker lyzosomů) Gomoriho metoda: 1. fáze - inkubace řezů v tekutině s glycerofosfátem sodným a dusičnanem olovnatým, fosfatáza vede k uvolnění fosfátových iontů. Ty reagují s dusičnanem olovnatým za vzniku bezbarvého elektrondenzního precipitátu fosforečnanu olovnatého. 2. fáze – roztok sirníku amonného – černá sraženina sirníku olovnatého Průkaz dehydrogenáz Inkubace nefixovaných řezů v roztoku substrátu – tetrazoliová sůl, substrát je akceptor uvolněných vodíkových iontů, jejich navázáním vzniká nerozpustná barevná sraženina formazanu. Př.: lokalizace sukcinát dehydrogenázy v mitochondriích. Průkaz peroxidázy Řezy se inkubují v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB (diaminoazobenzidin). DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován na černý elektrondenzní precipitát. Využití techniky DAB: klinika – diagnostika leukémií, značení v imunohistochemii 13

Imunohistochemie Imunocytochemické metody jsou vysoce specifické a používají se k průkazu určitých bílkovin a některých dalších makromolekul. Založené na imunitní reakci organismu proti cizorodým látkám (antigenům), organismus reaguje tvorbou specifických protilátek, které se vážou na antigen: komplex antigen x protilátka Protilátky – imunoglobuliny, tvořené plazmatickými buňkami (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) Polyklonální (z imunizovaného organismu, produkt několika klonů B lymfocytů - plazmocytů) – vysoká senzitivita, nízká specificita. Monoklonální protilátky (produkt jednoho klonu B lymfocytů) – mimořádně specifické Metody značení protilátek Enzymy – konvenční histochemie (např. peroxidáza – vizualizace DAB) Korpuskulární, částice koloidního zlata, ferritin (elektronová mikroskopie) Fluorochromy (fluorescenční mikroskop), akridinová oranž, rhodamin, FITC, TRITC, DAPI Biotin (avidin-biotin komplex) - ABC 14

Imunohistochemické metody Přímá metoda je jednovrstevná, tj. aplikuje se primární protilátka (proti hledanému antigenu) s navázanou značkou – primární protilátka značená přímo. Nutná dostatečná koncentrace antigenu ve tkáni. Pro světelnou mikroskopii není dost citlivá, vyhovuje elektronové mikroskopii. Protilátka Antigen Nepřímá metoda – dvojstupňová (sendvičová technika) Na antigen se naváže neznačená primární protilátka a na její Fc fragment se naváže sekundární protilátka – značená. Primární protilátka Sekundární značená protilátka Nepřímá trojstupňová metoda: zesílení signálu streptavidin-biotin, avidin-biotin Ross, Pawlina, Histology, 2006 15

Imunofluorescenční technika Imunoperoxidázová technika Průkaz gap junctions v semenoplodném epitelu při použití protilátek proti connexinu 43 Imunoperoxidázová technika Průkaz B buněk Langerhansových ostrůvků pomocí protiátek proti inzulinu Mikrofotografie: prof. Martínek Mikrofotografie: doc. Vernerová

Imunofluorescenční technika Imunoperoxidázová technika marker endotelových buněk CD34 v choriových klcích (placenta) - Alexa Fluor 532 (červená) a DAPI (modrá jádra) marker endotelových buněk CD34 v choriových klcích (placenta) - peroxidázová reakce Snímky: doc. Kučera

Elektronová mikroskopie Odběr: čerstvá tkáň, vzorek cca 1 mm Fixace: často tzv. dvojitá fixace aldehydové roztoky (formaldehyd, glutaraldehyd), kakodylátový pufr, např. Karnovského roztok 1-2% osmium tetroxid (korekce pH i osmolality) - kontrastování Zalévání umělé pryskyřice: epoxidové, metakrylátové, polyesterové želatinové kapsle Krájení polotenké řezy, orientace, barvení toluidinovou modří ultratenké řezy: ultramikrotom 40-60nm zachycení na síťky (měděné, niklové, zlaté) povlečené nosnou blanou (formvar), zpevněné nanesením uhlíkové vrstvy Kontrastování, uranylacetát, citronan olovnatý Transmisní elektronový mikroskop Mescher, Junqueira´s Basic Histology

Elektronová mikroskopie TEM, ultrastruktura makrofágu Přednášková prezentace je určena výhradně pro osobní studium studentů 1. LF UK. Mescher, Junqueira´s Basic Histology