IZOLACE A CHARAKTERIZACE PROTEINŮ BIOCHEMICKÉ METODY IZOLACE A CHARAKTERIZACE PROTEINŮ Jana Novotná

Charakterizace proteinu Molekulová hmotnost celého proteinu Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců Určení primární struktury Aminokyselinové složení Aminokyselinové sekvence Trojrozměrná struktura Izoelektrický bod proteinu Spektroskopické vlastnosti

Separační metody Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě elektrického náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie)

A. Separace založené na velikosti molekul Separační metody A. Separace založené na velikosti molekul Dialýza a ultrafiltrace Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem Propustnost membrány pro rozpuštěné látky Velikost povrchu membrány Pohyb částic < 1000 Da

Centrifugace v hustotním gradientu zkumavka je naplněná roztokem sacharózy s lineárně stoupající hustotou směrem ke dnu hladina gradientového roztoku se převrství směsí proteinů centrifugace za použití vysokých otáček, proteiny sedimentují určitou rychlostí podle velikosti, density a tvaru molekul (je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a částicí) po centrifugaci jsou proteiny v gradientu sacharózy rozděleny a zahuštěny Zóny obsahující zahuštěný protein

Gelová filtrační chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) Hydrofilní gelové částice (polymer) Uvnitř každé částice jsou póry Látky se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti)

Optimální gel pro gelovou filtraci by měl mít následující vlastnosti: inertní matrice gelu pro dělené složky i pro eluční roztoky. chemicky stabilní gel během několika kroků, při různém pH a při různé teplotě. mechanicky stabilní gel, aby se při větším tlaku nedeformoval. velikost gelových částic nesmí být ani příliš malá (rozdělení je přesnější, ale pomalejší) ani příliš velká (rozdělení je rychlejší, ale může být nepřesné). Na rychlou chromatografii tedy použijeme gel s hrubšími zrny. Na vysoký stupeň rozlišení použijeme gel s malými zrny.

B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů Izoelektrická precipitace rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje pH při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH3+ nebo COO- postranních řetězců aminokyselin v proteinu) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI. pH roztoku je nižší pI pH roztoku je vyšší náboj proteinu náboj proteinu + -

Rozpustnost proteinu prudce stoupá je-li v pH nižším než pI proteinu nebo v pH vyšším než pI proteinu (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se).

Vysolování neutrálními solemi Princip Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok Molekuly proteinu koagulují díky hydrofóbním interakcím

Vyšší koncentrace neutrální soli (NaCl, KCl) ovlivňuje rozpustnost globulárních proteinů. Povaha aniontu (Cl-) se ve vysolovacím efektu uplatňuje více než povaha kationtu Na+). Dvojmocné a vícemocné anionty jsou účinnější než jednomocné anionty {MgCl2 a (NH4)SO4 více než NaCl}. Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %).

Frakcionace organickými rozpouštědly etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda) sníží se stupeň ionizace a zvýší přitažlivé síly mezi opačnými náboji, tím se sníží rozpustnost. udržování roztoku při teplotách kolem Oo C se snižuje nebezpečí denaturace proteinu.

C. Separace na základě elektrického náboje Metody vycházejí z acidobazického chování proteinů (typ a počet ionizovatelných skupin aminokyselin) Elektroforetické metody Soubor separačních metod. Využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při elektroforéze dělí nabité molekuly (ionty): při pH > pI - protein je aniontem, má celkový (-) náboj – pohyb k anodě při pH < pI - protein je kationtem, má celkový (+) náboj – pohyb ke katodě

Zónová elektroforéza (dělení plasmatických bílkovin) Proužek acetátcelulózy – nanesení vzorku. Elektroforéza ( rozdělení podle různých elektroforetických pohyblivostí). Rozdělené proteiny na zóny. Densitogram (densita je přímo úměrná koncentraci)

Iontově výměnná chromatografie Různá afinita dělených molekul k povrchu gelových částic s kovalentně vázanými částicemi s nábojem. Proteiny se váží díky elektrostatickým interakcím. Síla vazby závisí: a. celkovém povrchové náboji (funkce pH pufru a pI proteinu)

Substance používaná k dělení má upravený povrch zrn (+) nabité gelové částice váží anionty DEAE celulóza (diethylaminoethyl) (-) nabité gelové částice váží kationty CM celulóza (carboxymethyl) navázané proteiny se z vazby uvolní změnou iontové síly nebo změnou pH roztoku procházejícího chromatografickou kolonou

D. Separace pomocí specifického ligandu Afinitní chromatografie (adsorpční) Využití biologických vlastností proteinů - specifická nekovalentní vazba s jinou molekulou (ligand)

použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex) enzym + koenzym hormon + receptor antigen + protilátka inhibitor+substrát lektin+cukr použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex)

Chromatografie na molekulovém sítu (gelová filtrace)

Určení molekulové hmotnosti z kalibrační křivky Kalibrační křivka Jednotlivé frakce proteinů se detekují spektrofotometrem. Rychlost průtoku proteinu je úměrná velikosti molekuly

Gelová elektroforéza Gel z polymerovaného akrylamidu (nebo agarózy). Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). Detergent SDS (sodium dodecyl sulfate) přidaný do dělícího pufru dodá všem proteinům celkový záporný náboj. Všechny proteiny migrují jedním směrem - k anodě.

Děkuji za pozornost