Výběr snímků k jednotlivým tématům předmětu: „Aplikovaná biologie buňky“

Kultivační podmínky vs buněčná dediferenciace ? Apl. biologie rostlinné buňky Suspenzní populace rostlinných buněk Rostlinný explantát callus Amorfní buněčná konsorcia Suspenzní buněčná populace Kultivace Testy znakové aktivity Testy stability znakové aktivity Znaková aktivita vs buněčná diferenciace Manipulace a podmínky vs buněčná dediferenciace Kultivační podmínky vs buněčná dediferenciace ?

Kompozice kultivačního prostředí Individuální variace zdroj C prekursory produktu specifická aditiva

Aparát biosyntézy sekundárního metabolitu….. „metabolické inženýrství“ ● dráha biosyntézy „flux“ ● buněčná lokalizace biosyntézy ● lokální limitace rychlosti biosyntézy ● kompetitivní dráhy ● regulace genového vyjádření ● stav buněčné populace

Sekundární metabolity (Albrecht Kossel, 1891) Funkce: efektoru faktoru (ekologické) selektivní výhody deponovatelná / odpadní forma produktu primárního metabolismu Produkce: vs buněčná diferenciace životní cyklus (stárnutí) růstové podmínky buněčná imobilizace Inter-organismální interakce Buněčná odpověď ----elicitace …biotické / abiotické elicitory (fytoalexiny) Klasifikace (rostlinných) sekundárních metabolitů ● hledisko funkce a strukturní příbuznosti Alkaloidy (bazické heterocykly - minimálně jeden atom dusíku) např. pyridiny, piperidiny, pyrrolidiny, tropany, isochinoliny, indoly, xantiny steroidní heterocykly Barviva flavonoidy, karotenoidy, chlorofyl Aromatické sloučeniny různě oxidované a substituované fenoly a chinony (kondensované struktury / konjugáty)

Rostlinná buňka - biologický činitel technologie (požadavky) ● stabilita genotypu / fenotypu znaky : buněčný tvar, buněčná agregace buněčná citlivost stav buněčné diferenciace fotosyntetická atrofie produkční aktivita (vztah produkční a růstové fáze) mikropropagace / makropropagace Reprodukovatelnost buněčné odpovědi P1, P2 : sledované produkty LR – BL : limitovaný růst BL : identifikace buněčné lyze

Apl. biologie živočišné buňky Buněčné kultury – základní příprava ■ enzymové / mechanické rozvolnění izolované tkáně kolagenasa (ex Clostridium histolyticum - „cell culture tested“, sterile-filtered version) ● redukce celkového počtu buněk schopných reprodukce ● tekuté medium: sole, AK, bílkoviny, Fe ● přítomnost vitálního buněčného typu vitaminy, glukóza, osmotická stabilizace, ● ztráta orgánové specifity aseptické podmínky, statická kultivace, ● typ a stáří výchozí tkáně neutrální pH, .. 37 OC ● příprava primární kultury ● kultivace

„Anchorage dependent cells“ ● makropórezní mikronosiče - povrchy dutých vláken - „3D“ kultury ● redukce střižných sil ● poměr objemu kultivovaných buněk / objemu media „scaffold“ ● „cell detachment“ ● buněčná permeabilizace Cytodex®

Buněčné linie Primární suspenzní kultura Diploidní buněčná linie Heteroploidní buněčná linie ● nelimitovaný buněčný potenciál (immortalised cell lines) ● růstový cyklus ● saturační hustota ● dokumentace - standardizace - „cell banking“

● indukce stavu resistence živočišné buňky k virové infekci ● INF – primárně produkt živočišné buňky (glykoprotein) ● typové rozlišení: IFN – α / α – Interferon ( 20 subtypů ) IFN - β / β – Interferon ( 2 subtypy ) IFN - γ / γ – Interferon ( 3 subtypy ) Typ II ● produkující buněčný typ: IFN – α ( více buněčných typů - leukocyty ); INF–ω, τ (α-2-typ ) IFN - β ( fibroblasty, makrofág, B - lymfocyty ) IFN - γ ( T – lymfocyty, NK ) ● vlastnosti: IFN – α ( pH 2 – stabilní; 16 – 26 kDa; hydrofóbní ) IFN - β ( pH 2 – stabilní; 20 -26 kDa; hydrofóbní ) IFN - γ ( pH 2 – nestabilní; 50 kDa; hydrofilní ) ● druhově specifické proteiny ● Typ INF vs induktor syntézy – typ produkující buňky Typ III (λ) Interferony Typ I

● mimobuněčné uvolňování (cytokiny: interleukiny, interferony, chemokiny, růstové faktory, faktory nekrotizující nádory) ● nespecifický anti-virový efekt ● indukovaná syntéza (ds RNA, syntetické polynukleotidy, bakteriální taxony, chemikálie, polymerní částice…antigeny) ● INFs jsou syntetizovány jako „navigované“ proteiny INF – α INF - β

Virová infekce vs. nespecifická (interferonová) a specifická (protilátky) imunitní odpověď

Produkující a aktivovaná buňka (anti-virový efekt INF) Společný typ receptoru pro INF – α, β

Proteiny anti-virové pohotovosti

● ne-antivirové účinky interferonů: funkce imunitního systému buněčná proliferace profil enzymové aktivity struktury buněčného povrchu (mnohočetný biologický účinek - více jak 30 genových produktů je pod vlivem IFN) ● vedlejší účinky klinických aplikací: autoimunitní reakce neurotoxicita kardiotoxicita ● Problematika klinických aplikací ● Použitelný preparát IRF – interferonem regulovaný faktor ISGF – interferonem stimulovaný růstový faktor ISRE – interferonem stimulovaný respondentní element TECHNOLOGIE vs experimentálně / klinicky použitelný preparát

Monoklonální protilátky Adaptivní (specifická) imunita - - Monoklonální protilátky ● nespecifická imunita - - (obecně fungující obranné mechanismy, neovlivněné předchozím kontaktem s imunogenem) ● specifická imunita - - ( získaná imunita, předchozí kontakt s imunogenem, paměť, imunitní odpověď)

► Imunogen = antigen (induktor imunitní odpovědi ) ► Epitop = antigenní determinant (nejmenší oblast antigenu schopná vázat protilátku) HI (humorální / protilátky) ► Specifická imunitní odpověď CMI (cell mediated immunity) – buněčná imunita ► Imunogen vs imunitní odpověď: bakterie (HI), viry (CMI), kvasinky(HI), prvoci (HI), vláknité houby (CMI), transplantáty (CMI), makromolekuly (HI) ► poměr HI / CMI

► buňky specifické imunitní odpovědi: T - lymfocyty ( Th, Tc, Tm ) B - lymfocyty antigen prezentující buńky (APCs) APC MΦ Tc

T - lymfocyt

Vývoj specifické imunitní odpovědi Humorální imunita Buněčná imunita

Imunogen – např. bakt. buňka

Imunogen virová částice

Interleukiny (IL)– regulačně aktivní peptidy (podskupina lymfokinů) - modulátory s proliferačním a diferenciačním signálem „lokální“ hormony IL-3: stimulace kostní dřeně IL-4: stimulace T-, B- lymfocytů IL-5 stimulace B-lymfocytů IL-6: stimulace plasmastických buněk IL-7: stimulace APCs INF-γ stimulace makrofágů

Humorální imunita - protilátky V C -S-S-

Variabilita epitopů vs specifita protilátky (106 – 109 možných vazebných variant protilátek) Úroveň kmenové buňky

Komplement

Sekvenční aktivace bílkovin komplementu

Monoklonální protilátky César Milstein, Georges Köhler, Niels Jerme (1975), 1984 HGPRT - HGPRT + hypoxantin-guanin-fosforibosyl trnasferasa HAT medium (hypoxantin, aminopterin, thymin)

Aplikace monoklonálních protilátek ■ detekce: léčiv, toxinů, hormonů, proteinů séra, znaků tumorů proteinů cytoskeletu….protilátek ■ radioimunodetekce / radioimunoterapie …cílená navigace léčiv ■ molekulová diagnostika pathogenů ■ antivirové preparáty ■ experimentální práce – diagnostika ■ IMUNOTERAPIE

Imunoterapie ● MP „nahé“ / „konjugované“ (+ chemoterapie) ● Populace Imuno-efektorových buněk: dendritické buňky,  lymfocyty, makrofágy… ● interferony… ● interleukiny…. Oligodeoxynukleotidy, glukany ● membránové frakce ● cílená příprava modifikátorů imunitní odpovědi ● angiogenní terapie ● diferenciační terapie ● inhibice receptoru, poteazomu… ● CAR T- Cell Therapies ● další vývoj

CAR T- Cell Therapies

Vakcíny Typy vakcin - princip přípravy ► virulentní organismus musí být „produkovatelný“ ► použitelná množství ► virulentní organismus nesmí být součástí vakciny ► avirulentní stav musí být nevratný ► stabilta / skladování ► vedlejší účinky vakcinace…. aplikace

Inaktivace infekčního agens ■ nevratný zásah biostatického / biocidního prostředku ■ první dávka indukuje humorální imunitu ■ vývoj imunitní paměti ■ 2. – 3. dávka → vývoj protekce (humorální imunita) Nevratná ztráta reprodukční aktivity Alternativně: toxin → toxoid „toxoidní vakciny“

Atenuace infekčního agens ■ nevratná ztráta virulence při zachování reprodukční aktivity infekčního agens ■ obecně silnější imunogenicita preparátu ■ komplexní imunitní odpověď - stabilita získané imunity ■ možná změna genotypu atenuovaného infekčního agens

Redukce infekčního agens - subjednotkové ( komponentové ) vakciny ■ redukce virulentního imunogenu na vybrané epitopy ■ desintegrace imunogenu ■ manipulace genového inženýrství ■ 100 % avirulence vakciny Hepatitis B virus HBsAg povrchový antigen ■ multi - subjednotkové vakciny

DNA vakciny ■ imunizace fragmentem DNA determinujícím klíčový epitop „terapeutické vakciny“

Bioinsekticidy ► vs chemický prostředek ► vs cílový taxon hmyzu ► entomopatogenita mikroorganismů a virů buněčná reprodukce virová infekce intoxikace ► zdroj entomopatogenu vs přirozena biologická kontrola výskytu hmyzu ► riziková toxicita entomopatogenu ► sporogenní druhy rodu Bacillus vs entomopatogenní houby a prvoci

Bacillus thurigiensis (Bt) (1901) ■ fakultativně anaerobní taxon, g+ ■ genomová identita s Bacillus cereus ■ asi 71 sérotypů / 84 ssp ■ sporogenní ■ parasporální krystalické inkluze (tvarová variabilta) ■ insekticidní krystalický protein (ICP) ■ vztah mezi morfologií inkluze, typem ICP a bioaktivitou ■ β – exotoxin ■ cry a cyt geny nomenklatura

Mechanismus biologického účinku ICP (Bt toxicita)

Mechanismus biologického účinku ICP (Bt toxicita)

Entomopatogenní viry Baculoviridae

Imobilizace enzymů a buněk ■ termín „imobilizace“ vs biologický materiál ■ význam „umělé imobilizace“ biologického materiálu ■ imobilizace enzymů ■ změny indukované imobilizací ■ charakterizace imobilizovaného biokatalyzátoru

A - imobilizace využívající povrch nosiče B - bez použití nosiče Metodologie imobilizace proteinů A B C Kombinace A : B : C „enkapsulace“ A - imobilizace využívající povrch nosiče B - bez použití nosiče C - zabudování / uzavření Volba metody – základní znaky metody - preferované techniky

Imobilizace buněk ■ důvody (vs imobilizace proteinů) ■ buněčný typ / intaktní stav buňky ■ fyziologický stav buňky před a po imobilizaci ■ metody imobilizace ■ význam zachování buněčné reprodukce ■ často frekventované metody vs imobilizace proteinů ■ umělá vs přirozená imobilizace buněk ■ buněčné upoutání kovalentní vazbou ■ společné rysy imobilizace proteinů a buněk

Použitelnost kovalentní vazby Carrier epoxide derivative spacer arm NH2 CHO monomeric dialdehyde Activated carrier modified by cell attachment

Lipozomy Cílená příprava membránových vesikulů – liposomů „umělé“ buněčné kompartmenty vs syntetická biologie buněčná minimalizace ….použitelnost přirozeného biologického komponentu Znaková biochemická aktivita …závislost na transportu a energii reprodukce ? liposom ….prostředek enkapsulace (Bangham, Horne, 1964) multilamelární multivesikulární

Aditivní modifikace povrchu liposomu

Typ a lokolizace ingredientů

Indukovaná fuze liposomů

Metodologie přípravy

nitrogenasa Biologická fixace N2 (n˃16) Komplex nitrogenasy N2 + 10H+ + nMg ATP → 2 NH4+ + H2 + nADP + nPi (n˃16) Komplex nitrogenasy ■ inhibován O2 (anaerobní podmínky, protekce) ■ obsahuje: molybdoferredoxin (komponent I, MoFe protein, „nitrogenasa“ azoferredoxin (komponent II, Fe protein, „reduktasa nitrogenasy) ■ molybdoferredoxin: α2β2 tetramer ( 2Mo a Fe7S8 centra) azoferredoxin: dimer identických subjednotek (Fe4S4 centrum) ATP ■ 2-5% z celkového obsahu proteinů ■ redukující aktivita vs širší spektrum substrátů nitrogenasa

Q B A L F W M V S U X N E Y K D H J p Klebsiella pneumonie nif regulon 51 60 50 22 28 42 45 25 18 50 40 24 60 56 36 120 Fe protein MoFe protein (azoferredoxin) (molybdoferredoxin) nif B,E,V,W,Z determinace syntézy MoFe kofaktoru nif Y inzerce MoFe kofaktoru nif U, S biosyntéza metalo-center nif X neznámá funkce nif Q Mo (transport) nif A, L, C regulační bílkoviny p

Rhizobium  / Bradyrhizobium  proces nodulace Stav „bakteroidu“

Mnohobuněčné konstrukty mikroorganizmů (buněčné kolonie, buněčné agregáty) přirozené biofilmy Společné znaky: Spontánní vznik Kolektivní systém Funkční diferenciace Mimobuněčná regulace Variabilita architektury Mechano-fyziologické interakce

Kompozice přirozeného biofilmu, určující faktory Uvolňování buněčné složky

Faktory ovlivňující stav a funkci biofilmu Biologická individualita – zastoupení taxonů, interakce subpopulací Vztahy subpopulací – závislost na kontaktu,závislost časová, metabolická,horizontální přenos genetické informace Úloha EPS – prostorová distribuce, stabilita a rezistence, difusní bariéra, biosorpce, stav hydratace Mezibuněčná signalizace

Bioremediace Bioremediace – zásah in- situ, ex-situ Perzistentní polutant Komplexní polutant Dostupnost polutantu (bioavailability) Toxicita polutantu / toxicita prostředí Nutriční závislost biodegradace Autochtonní mikrobiota vs technologická Celková znalost kontaminovaného prostředí

Účinnost bioremediace (biodegradace) je vždy určena: metabolickým potenciálem působícího mikroorganismu(ů); b) jeho fyziologickou adaptabilitou; c) jeho reprodukční aktivitou; d) přítomnými induktory sporogeneze e) citlivostí mikroorganismu k působení stresorů cílového prostředí; f) profilem a variabilitou ostatních nutrientů; g) citlivostí k nutriční deficienci; h) citlivostí k cytotoxickému působení odbourávaného polutantu, včetně intermediátů jeho degradace; ch) citlivostí ke stresorům prostředí;

i) stavem a adaptabilitou struktur buněčného povrchu j) mezibuněčnými interakcemi k) změnou zastoupení taxonů biodegradérů l) schopností kolonizovat povrchy prostředí (vznikem biofilmu) m) remediační účinností biofilmu