Proteinové, buněčné a tkáňové čipy

Slides:



Advertisements
Podobné prezentace
Radioimunoesej, enzymoimunoesej – princip, využití
Advertisements

AUTOPROTILÁTKY V DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH IMUNOPATOLOGICKÝCH
Selhání imunitní tolerance: alergie a autoimunita
Detekce proteinů na preparátech Histochemie. Metody detekce – vazba cílového proteinu Imunologické; primární protilátky sekundární protilátky Imunologické;
Vyšetření parametrů buněčné imunity
Metody s využitím reakce antigen-protilátka
Transkripce (první krok genové exprese)
Základní imunitní mechanismy
Vyšetřování parametrů humorální imunity
Metabolismus A. Navigace B. Terminologie E. Sacharidy I. Enzymy
Laboratorní metody 2 Kurs Imunologie II.
Molekulární diagnostika neurofibromatózy typu 1 Kratochvílová A., Kadlecová J., Ravčuková B., Kroupová P., Valášková I. a Gaillyová R. Odd. lékařské genetiky,
FUNKCE PROTEINŮ.
Nanokrystalické oxidy kovů Libor Libor Machala
J. Weiser Laboratoř mikrobiální proteomiky Proteomika jako nástroj ke studiu fyziologických regulací u bakterií.
Transkriptom.
(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA
Průtoková cytometrie základní princip a klinické využití
BUNĚČNÁ SIGNALIZACE.
Způsoby mezibuněčné komunikace
Řízení imunitního systému Kurs Imunologie. Hlavní histokompatibilní systém (MHC) objeven v souvislosti s transplantacemi starší termín: HLA dvě hlavní.
JEDEN HORMON JEDNA CÍLOVÁ TKÁŇ JEDEN EFEKT (ÚČINEK) Toto je ideální situace, která ve skutečnosti existuje jenom zřídka (hypofyzární tropní hormony).
Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod:
Molekulární biotechnologie č.6b Zvýšení produkce rekombinatního proteinu.
ELISA, určení ideálních koncentrací reaktantů -různé varianty
Hormonální akcí rozumíme procesy, ke kterým dochází v cílové buňce poté, co buňka přijme určitý hormon prostřednictvím svých receptorů a zareaguje na.
EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE Transkripce
SÉROLOGICKÉ REAKCE reakce mezi antigenem a protilátkou význam in vivo
Prediktivní a prognostická patologie Prediktivní a prognostická patologie Část I Část I.
Radovan Horák, Romana Zaoralová, Jiří Voller
Analýza a separace nukleových kyselin
Imunochemické metody řada metod založených na principu reakce:
Microarray Martin Erdös.
DNA diagnostika II..
Proteinové, buněčné a tkáňové čipy
EVROPSKÝ FOND PRO REGIONÁLNÍ ROZVOJ
Laboratorní diagnostika
Expresní DNA microarray
Moderní metody analýzy genomu Čipové technologie II
Molekulární biotechnologie Č.3. Izolace cílového fragmentu DNA (genu) Který představuje malou část genomu (0.02% u E.coli) Umožňují genové či genomové.
Technologické aspekty čipových technologií Boris Tichý LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno.
IMUNOESEJE.
Moderní metody analýzy genomu
Proteinové, buněčné a tkáňové čipy
Mikročipy ..
V praktiku budou řešeny dvě úlohy:
Protilátka (imunoglobulin)
Molekulární biotechnologie č.10a Využití poznatků molekulární biotechnologie. Molekulární diagnostika.
Western blotting Slouží pro detekci proteinů prostřednictvím protilátek. Obvykle následuje po rozdělení polypeptidů v elektrickém poli polyakrylamidovou.
Ligázová řetězová reakce
RNA savčí buňka: pg celkové RNA rRNA (28S,18S, 5S) 80-85% tRNA, snRNA 15-20% mRNA 1-5% mRNA molekul/buňku, tj rozdílných transkriptů.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA. Biochemická metoda Detekce protilátky (Ab) nebo antigenu (Ag) Historie: Radioimunoassay – použití radioaktivně.
Imunochemické metody Metody využívající vazbu mezi antigenem a protilátkou Vytášek 2008.
Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese
Vyšetření specifické imunity
TRANSKRIPCE DNA.
MOŽNOSTI DETEKCE LIKVOREY
Vyšetřování parametrů buněčné imunity
DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay
Ivana Eštočinová, Pavla Fabulová, Markéta Formánková
IMUNOESEJE.
Proteomika Bruno Sopko.
Laboratorní diagnostika
Molekulární biotechnologie
Imunologie seminář 1 Imunologie seminář 1 J. Ochotná
Western blotting Slouží pro detekci proteinů prostřednictvím protilátek. Obvykle následuje po rozdělení polypeptidů v elektrickém poli polyakrylamidovou.
Základy genomiky V. Analýza protein-proteinových interakcí Jan Hejátko
1. Regulace genové exprese:
MiRNA
Protilátky využívané v diagnostice Monoklonální protilátka – je produkována klonem buněk pocházejících z jedné plazmatické buňky; váže se velmi specificky.
Transkript prezentace:

Proteinové, buněčné a tkáňové čipy Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Molekulární medicína, CEITEC MU Proteinové, buněčné a tkáňové čipy Jitka Malčíková 27.11.2012

Proteom (miliony proteinů) Genom (20-25 tis genů) Transkriptom Proteom (miliony proteinů) Dynamický systém – odráží momentální stav buňky Hladina proteinu často nekoreluje s hladinou mRNA Transkripce Posttranskripční modifikace Alternativní sestřih Translace Odbouráváni mRNA Posttranslační modifikace Alternativní konformace

Proteomika Proteom - soubor všech proteinů v daném biologickém systému (buňka, tkáň, organizmus) Klinická proteomika - studuje celkový buněčný proteom v klinických vzorcích Cíl - identifikovat a charakterizovat proteiny zapojené do vzniku a vývoje onemocnění

Proteomické metody Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE) Časově, finančně náročné Těžko reprodukovatelné Dvoubarevné značení – DIGE 2D Kapilární elektroforéza Hmotnostní spektrometrie Proteinové čipy Vysokokapacitní Poměrně jednoduché zpracování Expresní i funkční studie Vyžadováno minimální množství vzorku

Proteinové čipy Expresní Funkční stanovení přítomnosti a koncentrace proteinů v komplexních vzorcích Protilátkové čipy Lyzátové čipy Antigen čipy Funkční studium interakce proteinů s jinými molekulami proteiny, peptidy, nízkomolekulární látky, oligosacharidy, DNA

Princip proteinových čipů Vazba protilátka-antigen - mikrospot ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Systém využívající malé množství vázané protilátky a malého objemu vzorku je citlivější než systém se stonásobně větším objemem materiálu Citlivost řádově ve femtomolech - 106 molekul/ml Množství navázané molekuly je sice velmi nízké, ale v rámci mikrospotu lze dosáhnout vysoké hustoty Stanovení koncentrace analytu ve vzorku Koncentraci přímo odpovídá množství vázaného analytu (Ekins RP, J Pharm Biomed Anal. 1989)

Princip proteinových čipů Stovky – tisíce proteinů imobilizovaných ve formě mikrospotů na pevném povrchu membrány (polystyrenové, PVDF - polyvinyliden fluorid, nitrocelulosové) standardní mikroskopická sklíčka s chemicky modifikovaným povrchem (poly-lysin, aldehydické skupiny) potažená membránou Detekční metody Nejčastěji fluorescence Enzymaticky – značení alkalickou fosfatázou, křenovou peroxidázou Chemiluminiscence Radioaktivita Zvýšení signálu – značení biotinem – vazba na značený streptavidin Hmotnostní spektrometrie

Čipy pro stanovení antigenů Protilátkové čipy Přímý formát (FPA- forward phase arrays) Na povrchu spotované protilátky (velikost spotu 0,3-0,5 mm) Inkubace se vzorkem Detekce stovek antigenů ve vzorku Expresní profilování – „large-scale“ monitorování proteinové exprese Cílené na určité buněčné procesy (buněčný cyklus, cytokiny, MAPK dráha, p53 dráha…) Lyzátové čipy Zpětný formát (RPA – reverse phase arrays) Na povrchu spotované vzorky (proteinové, tkáňové lyzáty, sérum) Inkubace se specifickými značenými protilátkami Srovnání exprese až desítek antigenů u stovek různých vzorků Nevýhoda – malá hustota studovaných molekul ve spotu – pre-frakcionace pomocí 2D kapalinové chromatografie Přímé značení Sendvičová metoda Možnost dvoubarevné detekce Vyšší citlivost a specifita Xiaobo et al. 2010 Xiaobo et al. 2010

Čipy pro stanovení protilátek Antigen čipy Na povrchu spotované známé antigeny syntetické proteiny, peptidy Inkubace se sérem obsahujícím studované protilátky Detekce přítomnosti protilátek ve vzorku, nejčastěji v séru Xiaobo et al. 2010

Bead array - mikrosféry průměr ~ 5-10 μm (velikost lymfocytu) polystyrenové nebo latexové kuličky „kódovány“ rozdílnými barvami nebo velikostmi Detekce – na principu flow cytometrie rozpoznávání rozdílně kódovaných mikrosfér identifikace a kvantifikace proteinů ve vzorku Množství stanovovaných proteinů je limitováno počtem druhů mikrosfér (~500) Možnost automatizace Využití – cílené – zejména detekce cytokinů, protilátek (alergie, autoimunita), ale např. i detekce fúzních proteinů a onkoproteinů www.lucerna.chem.ch

Buněčné čipy Přímý formát Spotované protilátky Inkubace s buněčnou suspenzí Např. spotované CD molekuly – inkubace s leukocyty – charakterizace leukemických buněk „Transfekční čipy“ - buňky rostou na povrchu čipu s naspotovanou cDNA Během růstu přijmou cDNA Čip se spoty buněk exprimujících různé cizorodé proteiny

Buněčné čipy Detekce Přímo mikroskopicky na sklíčku Další charakterizace značenými protilátkami

Tkáňové čipy Varianta RPA čipů (zpětný formát) Spotují se celé vzorky tkání např. bioptických Inkubace se značenými protilátkami Velikost spotu 0,6 - 2mm

SELDI Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation Inkubace lyzátů na makrospotech adsorpčního povrchu s různou povrchovou úpravou Nespecifická vazba proteinů Detekce hmotnostní spektrometrií Nižší citlivost Umožňuje vyhledávání neznámých biomarkerů

Funkční čipy Studium interakce s jinými molekulami Inkubace s jinými proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy, terapeutika, …) Studium posttranslačních modifikací Studium enzymatické aktivity Studium kofaktorů a inhibitorů Studium interakcí ligand-receptor

Spotovány nativní proteiny Potřeba zachování struktury a biologické aktivity Problém imobilizace, zachování konformace a orientace na čipu i během skladování 1. funkční čipy – mikrojamičky v silikonovém elastomeru na povrchu mikroskopického sklíčka (Zhu et al., Nat Genet 2000) Nespecifická vazba přímo na povrch Adsorpce Kovalentní vazba přirozených chemických skupin proteinu na upravený povrch Aktivní část proteinu může být schovaná, problém zachování konformace Chemoselektivní vazba – připojení chemické skupiny na definovanou pozici proteinu → specifická reakce s komplementární chemickou skupinou na povrchu sklíčka Orientovaná pozice na sklíčku Imobilizace přes specifický rekombinantní tag

Imobilizace přes rekombinantní tag Během syntézy studovaného proteinu se na C nebo N konec přidá afinitní tag, který specificky interaguje s povrchem čipu Zachování orientace, konformace Funguje jako „spacer“ – oddálení proteinu od povrchu - odkrytí reaktivních míst a umožnění interakcí Poly(aminokyseliny) – poly(His), poly(Cys), poly(Lys) Glutathion-S transferáza (GSH) MBP (maltózu vázající protein) Biotinylovaný tag … protein attachment biotinylation 50Å

Využití interakce biotin - streptavidin Rekombinantní proteiny exprimované v E.Coli Proteiny jsou vázané na sklíčko přes afinitní „tag“ Biotinylated Carboxyl Carrier Protein (BCCP tag) BCCP tag je správně složen pouze pokud je protein správně složen Pouze správně složený BCCP tag je biotinylován Pouze biotinylovaný protein se váže na streptavidinem pokryté sklíčko cDNA rec rec promoter BCCP Boutell et al., Proteomics. 2004

Využití interakce biotin - streptavidin správně složený protein biotinylovaný BCCP tag streptavidinem pokryté mikroskopické sklíčko

Analýza DNA-vazebných schopností p53 mutantů P53 array – 50 variant p53 wt 48 mutací – 43 missense, 5 nonsense polymorphismus R72P Studium efektu mutací a polymorfismů na interakci s jinými proteiny na konformaci – konformačně-specifická protilátka na vazbu k DNA - vazba proteinů navázaných na čipu k fluorescenčně značeným oligonukleotidům obsahujícím responzivní elementy p53 cílových genů

In situ syntetizované čipy „Samoskládací“ (Self-assembling) cDNA naspotovaná na sklíčku → in vitro translace → in situ imobilizace N Ramachandran et al. Science 2004

Další typy funkčních čipů Doménové čipy Spotovány pouze jednotlivé domény proteinu Pochopení protein-proteinových interakcí Peptidové čipy Inkubace s proteiny, DNA, malými molekulami (oligosacharidy, terapeutika, …) Čipy s chemickými knihovnami Inkubace s proteiny (enzymy, receptory…) Studium inhibitorů, studium ligand-receptorových interakcí- vyhledávání terapeutik

Molekuly imobilizované na čipu Typ čipu Molekuly imobilizované na čipu Stanovované molekuly Inkubace Počet spotů Použití expresní protilátkové (přímý formát) známé protilátky antigeny neznámý vzorek - proteinový lyzát  1000 proteinové profilování lyzátové (zpětný formát) neznámý vzorek - proteinový lyzát známé protilátky 1000 antigen čipy známé antigeny protilátky neznámý vzorek – protilátky v séru stanovení přítomnosti protilátek v séru funkční protein- protein známé proteiny v nativním, funkčním stavu nebo peptidy, nebo chemické látky partnerské molekuly interagující s proteiny proteiny 100 studium interakcí proteinů s partnerskými molekulami protein- DNA, RNA protein- nízkomoleku lární látky Enzym- substrát

Využití Studium biomarkerů – diagnostické, prognostické, prediktivní Identifikace terapeutických cílů Studium vlivu terapie Detekce autoprotilátek, studium imunitní odpovědi In vitro diagnostika – více než u ostatních typů čipů Nejčastěji diagnostika autoimunitních onemocnění Diagnostika infekčních onemocnění