C7900 Lehká biotechnologie 03.2 – Vitamin B2 Petr Zbořil

Osnova prezentace Výroba riboflavinu

Riboflavin Biochemická role Fyziologické projevy FMN, FAD Projevy na sliznici jazyk, spojivky atrofie papil opar Není kritické

Riboflavin Výskyt a získávání Mikrobiální produkce Denní potřeba Maso, vnitřnosti, mléko (tvaroh), kakao Vegani – problém! Mikrobiální produkce Ruminální mikroflora – zdroj pro býložravce Ostatní mikroflora neefektivní, nutnost dodávky Denní potřeba Ca 1-2 mg Tabulka doporučených dávek – bezvýznamné variace Nelze předávkovat Komplexní přípravky resp.

Riboflavin Dávkování Recommended Dietary Allowances, 10th Edition. věk (roky) riboflavin [mg] Kojenci 0,0-0,5 0,4 0,5-1,0 0,5 Děti 1-3 0,8 4-6 1,1 7-10 1,2 Muži 11-14 1,5 15-18 1,8 19-24 1,7 25-50 51+ 1,4 Ženy 1,3 50+ Těhotné ženy 1,6 Kojící ženy Dávkování Recommended Dietary Allowances, 10th Edition. Food and Nutrition Board, National Research Council– National Academy of Sciences, 1989

Riboflavin Biosyntéza u prokaryot a chemická syntéza RibA, RibD RibH Bifunkční enzymy RibH RibD Substráty GTP, Rul-5P Jiné dráhy Prekurzory puriny Diacetyl – AcCoA Ribitol z glukosy

Riboflavin Technologie – fermentační Suroviny Sacharidy, forma závisí na požadované čistotě, schopnosti producenta využít daný typ suroviny apod. Čisté – sacharosa, glukosa Hrubé – melasa Přírodní materiály – kukuřice, rýže … Další faktory dle nároků producenta

Riboflavin Producenti – vysoká koncentrace Kvasinky Bakterie Smysl – ochrana proti UV Plísňové onemocnění netopýrů Kvasinky Eremothecium ashbyi, Ashbya gossypii Nejvýznamnější, až 2 g na 1 L Citlivé na kontaminace, delší fermentace Candida guillermondii, C. flareri Citlivé na stopy Fe, menší koncentrace Bakterie Clostridium acetobutylicum Vedlejší produkt, výpalky ca 1-2 mg B2 v 1 L

Riboflavin Výběr vhodných kmenů Historie – Eremothecium ashbyi resp. Ashbya gossypii zavedeny 1940, nahrazeny chemickou syntézou (1950), neúspěšné pokusy s C. famata, 1970 vylepšená technologie s Ashbya gossypii (Merck, pak BASF) Paralelně s chemickou syntézou, ta pak opuštěna Dnes výhradně fermentací, ca 4000 t za rok Vede DSM Nutr. Prod. (CH, závod v j. Německu) BASF (D, závod v J. Korei) Hubei Guangji (PRC) Experimentální proces s B. subtilis v Rusku

Riboflavin Výběr vhodných kmenů Poměrně variabilní mikroorganizmy Eremothecium ashbyi resp. Ashbya gossypii Poměrně variabilní mikroorganizmy Snadno mutují, revertují – bílé kolonie bez B2 Žluté až oranžové hromadí B2 Bílá mutace trvalá, žluté štěpí na bílou Kultivace střídavě na tekutých a tuhých půdách Polosyntetické i komplexní, výběr oranžových kolonií Morfologické posuzování

Riboflavin Propagace Produkční půda Inokulum na tekuté půdě, 48 hod., 30 oC Produkční půda 4% sojová mouka 4% glukosa 0,5% pepton 0.1% KH2PO4 pH 6,8 – 7,0

Riboflavin Fermentace Submerzní Syntetické medium + doplňky Cukr 4-5 % (glukosa, sacharosa, melasa) Výpalky místo syntetické části Bílkoviny živočišné – kasein, mléko, syrovátka Rostlinné materiály – mletá čočka, soja Úprava pH, sterilizace (glukosa zvlášť) 10 % inokula 4 fáze – I růst mycelia, II – tvorba spor, III – produkční, IV – rozrušení mycelia

Riboflavin % mg/L 800 4 glukosa B2 I II III IV dny

Riboflavin Fermentace povrchová Levnější alternativa Hrubé produkty Krmivářské účely Substrátem otruby, plevy apod. Doplnění živinami

Riboflavin Izolace Pro krmivářské účely Vysušení půdy s myceliem nebo bez nerozpustného podílu (po hydrolýze) – další nutriční faktory Pro potravinářství, farmakologické účely apod. A) Biochemickou redukcí a oxidací B) Chemickou – dtto C) Adsorpcí a desorpcí D) Extrakcí

Riboflavin A) Izolace s využitím biochemické redukce Dihydroriboflavin – leukoforma, nepolární Hydrolýza mycelia – pH 4,5 (HCl, H2SO4), 90 oC, 1 hod. Úprava pH na 6,5 (NaOH), filtrace Zaočkování (E. coli, C. acetobutylicum), 1-2 dny anaerobně Dekantace, filtrace, pevný podíl (B2 + balasty) rozpustit v etanolu (glycerol i jiné) v inertní atmosféře (bez O2), filtrace za horka Filtrát probublat vzduchem, 1-2 hod. Vypadlé krystalky promýt etanolem, vysušit

Riboflavin B) Využití chemické redukce C) Adsorpce Rychlejší, preparáty však méně čisté Redukce thiosíranem při pH 5-5,5 (lze i SnCl2 apod., stopy v produktu!) Mírný nadbytek činidel, výtěžek kolem 90 % C) Adsorpce Variabilní výsledky, technologie není spolehlivá Adsorpce na C, křemelinu, desorpce pyridinem (+ příp. kyselina octová) D) Extrakce butanolem pod CO2 za redukce – 80 % do butanolu, bez redukce 40% Opakovaná extrakce – výtěžek přes 95 %

Riboflavin Děkuji za pozornost