Vyšetřování parametrů humorální imunity

Imunochemické metody řada metod založených na principu reakce: antigen (Ag) + protilátka (Ab) → imunokomplex (IK) stanovujeme buď Ag nebo Ab (obecně analyt)

Vyšetřování humorální imunity Imunoprecipitace v roztoku - Nefelometrie - Turbidimetrie Imunoprecipitace v gelu - Imunodifuze - Elektroforéza Aglutinace (Ag – korpuskulární charakter; IgM, IgG) Komplementfixační testy (Ab+Ag+komplement) Imunoreakce se značenými protilátkami (EIA, ELISA, RIA) Imunobloting (southerblot, notherbloting,westernbloting) imunofluorescence

Imunoprecipitační křivka

Zákalové metody: nefelometrie a turbidimetrie Použití: používá se prostanovení vzorků o vyšších koncentracích proteinů stanovení množství (koncentrací) běžných proteinů lidského séra (jednotlivé třídy Ig, CRP, RF, složky komplementu C3 a C4, C1 INH)

Nefelometrie ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D Princip: základem metody je měření intenzity odraženého světla od zákalu vzniklého reakcí Ag – Ab. Z – zdroj (laser, výbojka) K – kyveta se vzorkem D – detektor D ↑ Z →→→→ K (Ag-Ab) ↓ D  

Nefelometrie Vyhodnocení: dle kalibrační křivky sestavené pomocí standardu (Ag o známé koncentraci) a získaných odpovídajících hodnot intenzity odraženého světla intenzita odraženého světla koncentrace Ag

Turbidimetrie Princip: měří úbytek intenzity světla po jeho průchodu kyvetou obsahující IK   Zdroj – Kyveta – Detektor jsou umístěny v jedné přímce: Z →→→→ IK (Ag-Ab) → D Vyhodnocení: dle kalibrační křivky

Radiální imunodifuze Postup: gel smícháme s Ab → inkubace s Ag → Ag difunduje do okolí a tvoří s Ab imunokomplexy (IK) → prstencový precipitát   Hodnocení: změří se průměr prstence a koncentrace Ag se odečte na kalibrační křivce Použití principu RID: stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu, funkční test C1 INH

Jednoduchá radiální imunodifuze ( S1 – S7 – standardy, V1 – V2 – vzorky)

Dvojitá imunodifuze Ouchterlony pasivní dvojitá imunodifuze - difunduje Ag i Ab používá se pro stanovení extrahovatelných jaderných antigenů Identické antigeny neidentické antigeny částečně identické antigeny

Aglutinace (shlukování) Antigen v této reakci má korpuskulární charakter (např. erytrocyt, bakterie, Ag navázaný na latexové častici…) Protože protilátka (IgG, IgM) má více vazebných míst, dochází ke shlukování částic či buněk na jejichž povrchu je lokalizovaný Ag

EIA – enzyme immunoassay skupina metod Společný princip: použije se Ag nebo Ab značená enzymem (Ag*, Ab*) → po navázaní s hledaným Ag nebo Ab ze vzorku je tak enzymem označen celý IK (Ag-Ab*, Ab-Ag*) → enzym reaguje s přidaným substrátem za vzniku výsledného produktu, který detekujeme Vyhodnocení: pomocí kalibrační křivky (Ag o známé koncentraci – standardy- a k nim změřené vlastnosti produktu – př. intenzita zbarvení)   Použití: kvantitativní stanovení malých množství některých proteinů (př. specifických Ab, hormonů, cytokinů, TU markerů...)

EIA – enzyme immunoassay Dělení EIA metod: a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu: ELISA (fotometrická detekce barevného produktu) FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného produktu) LEIA (luminometrická detekce světla uvolněného/emitovaného při změně chemické struktury substrátu) b) dle postupu: heterogenní x homogenní kompetitivní x nekompetitivní

EIA – enzyme immunoassay ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay = heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevnatá (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je v konečné fázi vázán mezi dvěma vrstvami: Ab-Ag-Ab* nebo Ag-Ab-Ab* Princip: pevná fáze je pokryta př. Ag → přidáme vzorek s hledanou Ab → tvorba IK (Ag - Ab) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ → vzniká komplex Ag-Ab-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce → vznik barevného produktu

ELISA Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky

ELISA

ELISA

ELISA

EIA – enzyme immunoassay Pozn: FEIA – fluoroenzymoimunoanalýza - výsledkem reakce je fluoreskující produkt hodnocení: dle kalibrační křivky! - fluorometr měří intenzitu fluorescence použití: př. stanovení specifických IgE LEIA – luminoenzymoimunoanalýza – výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu - způsobí uvolnění fotonů - světélkování hodnocení: dle kalibrační křivky! - luminometr měří intenzitu emitovaného světla použití: př. stanovování hladin specifických IgE, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.

RIA – radioimunoanalýza Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním isotopem (rozdíl od metody EIA)→ následně označen IK vysoká citlivost a specifičnost nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení, bezpečnost práce Použití: př. stanovování hladin některých hormonů, TU markerů, ...

Nepřímá imunofluorescence Postup: 1. inkubace pacientova séra (Ab) se substrátem (Ag) fixovaným na podložním sklíčku 2. inkubace s anti-lidskou protilátkou značenou např. FITC (anti-human IgM/FITC, anti-human IgG/FITC, anti-human IgA/FITC) 3. detekce pomocí fluorescenčního mikroskopu

Nepřímá imunofluorescence