Pacient s podezřením na LGMD2 – který gen analyzovat????? Pletencové svalové dystrofie (LGMD) 7 LGMD s AD typem dědičnosti (LGMD1A-G); 19 LGMD s AR typem dědičnosti (LGMD2A-S) Limb girdle dystrophies: Recessive   2A: Calpain-3 ;15q15   2B: Dysferlin; 2p13.1   2C: γ-Sarcoglycan; 13q12   2D: α-Sarcoglycan; 17q21   2E: β-Sarcoglycan; 4q12   2F: δ-Sarcoglycan; 5q33   2G: Telethonin; 17q12   2H: TRIM32; 9q33   2I (MDDGC5): FKRP; 19q13   2J: Titin; 2q24   2K (MDDGC1): POMT1; 9q34   2L: ANO5; 11p14   2M (MDDGC4): Fukutin; 9q31   2N (MDDGC2): POMT2; 14q24   2O (MDDGC3): POMGnT1; 1p32   2P (MDDGC7): DAG1; 3p21   2Q: Plectin 1f; 8q24   2R: Desmin; 2q35   2S: TRAPPC11; 4q35 Limb girdle dystrophies: Dominant   1A: Myotilin; 5q31; Dysarthria   1B: Lamin A/C; 1q21; + Cardiac   1C: Caveolin-3; 3p25; Child onset   1D: DNAJB6; 7q36   1E: Desmin; 2q35   1F: TNPO3; 7q32   1G: HNRPDL; 4q21   1H: 3p23 Pacient s podezřením na LGMD2 – který gen analyzovat????? http://neuromuscular.wustl.edu/musdist/lg.html#2a

LGMD, analysis of muscle tissue Western blotting of calpain-3; 1, 2: normal control, 3 - 6: absence of calpain-3 on 94kDa in LGMD2A patients. (FNB, PAU, Hermanová M.) A B Immunodetection of alpha-sarcoglycan; A: normal control, B: deficiency of alpha-sarcoglycann in a LGMD2D patient. (FNB, PAU, Hermanová M.)

Svalové vlákno (počet ve svalu 10 tisíc – 1 milion, délka cm až dm, průměr 10 – 100 µm). Myofibrila, svalové vlákénko, základní kontraktilní jednotka svalové buňky. Stavba myofibril způsobuje příčně pruhovaný vzhled svalu (tmavé a světlé pruhy). Ten vzniká uspořádáním dvou druhů bílkovinných vláken - aktinových filament a myosinových filament. Aktinová vlákna jsou zakotvena v Z-linii, rozdělující myofibrily v jednotlivé sarkomery, úseky dlouhé v klidu cca 2,2 – 2,8 µm. Sarkomera tedy leží mezi dvěma Z-liniemi. V blízkosti Z-linie tvoří sarkomeru pouze aktinová filamenta, tato část se nazývá I-proužek. Směrem ke středu sarkomery se nachází A-proužek, kde se překrývají aktinová a myosinová vlákna. O něco světlejší středová část sarkomery obsahující jen myosinová vlákna se označuje jako H-proužek (linie H). Jednotlivé linie a proužky se v myofibrile střídají, čímž vzniká vzhled pruhování. Při stahu svalu (kontrakci svalu) se délka sarkomery zkracuje (aktinová a myosinová filamenta se do sebe vzájemně zasouvají).

LGMD2A, CAPN3 CAPN3: calcium-dependent protease, do not completely demolish substrates but cleave them in a controlled and limited manner. CAPN3 is the first enzyme described in association with muscular dystrophy. Majority of CAPN3 is anchored to the cytoskeleton of sarcomere, bound to the gigantic protein titin.

LGMD2A, CAPN3 Anchoring to titin has a triple function: to keep CAPN3 from autolytically degrading itself, to maintain it in a proteolytically inactive state, to place it in proximity of its substrates.

LGMD2A, CAPN3 CAPN3 - main roles - to rid the cell of damaged sarcomeric proteins and in this way contribute to maintenance of effectively functioning muscle. E3 ligase is the final enzyme in the process of adding polyubiquitin chains to protein substrates, targeting them to the proteasome. Compatible with the fact that the E3 ubiquitin ligase TRIM32, when mutated can also give rise to LGMD2H. Neuromuscul Disord. 2008; 18(12): 913–921

LGMD, DNA diagnostika PCR, sekvenční analýza exonů genů CAPN3, FKRP, SGCA, ANO5 (výběr na základě četnosti výskytu v evropských populacích) Počet pacientů s LGMD zaslaných k analýze 218 LGMD2A, CAPN3, calpain-3; počet pacientů s mutací: 71 (32,6%) LGMD2I, FKRP, fukutin related protein; počet pacientů s mutací: 9 (4,1%) LGMD2D, SGCA, alpha-sarcoglycan; počet pacientů s mutací: 6 (2,8%) LGMD2L, ANO5, anoctamin 5; počet pacientů s mutací: 3 (1,4%) Diagnóza potvrzena u 40,8% pacientů

„Sequence Capture“ (SeqCap EZ Choice Library, NimbleGen) a cílená sekvenace (MiSeq, Illumina) Postup: Zadání cílových úseků, design sond Příprava knihovny DNA (fragmentace DNA, ligace adaptorů) Hybridizace se sondami s navázaným biotinem Vychytání sond s navázaným fragmentem DNA pomocí magnetických kuliček s navázaným streptavidinem Amplifikace Sekvenace

NMD, SeqCap-TR „Sequence capture” a sekvenace genů spojených s vybranými skupinami neuromuskulárních nemocí Svalové dystrofie – 38 genů Kongenitální svalové dystrofie – 27 genů Kongenitální myopatie – 23 genů Distální myopatie – 19 genů Další myopatie – 16 genů Myotonické syndromy – 6 genů Svalové nemoci spojené s iontovými kanály – 13 genů Kongenitální myastenické syndromy – 19 genů Nemoci motorického neuronu – 50 genů Další neuromuskulární nemoci – 27 genů

Analýza doposud provedena u 146 pacientů SeqCap-TR, výsledky (březen 2015) Analýza doposud provedena u 146 pacientů u 61 pacientů (42%) byly identifikovány kauzální mutace u 36 pacientů (25%) máme mutace, ale jejich kauzalitu je ještě nutno ověřit analýzou rodičovské DNA (jsou to především potenciálně dominantní mutace v genech (RYR1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, DNM2, LMNA,….) 49 pacientů (33%) je zatím bez kauzální mutace/mutací

Nelze detekovat varianty v nekódujících oblastech genů SeqCap-TR Nelze detekovat varianty v nekódujících oblastech genů Nelze detekovat delece/duplikace postihující celé exony a velké přestavby v genech Není vhodnou metodou pro nemoci spojené s expanzí repetitivních sekvencí Sekvenujeme cca 90-95% vybraných oblastí Identifikace nových sekvenčních variant s neznámou kauzalitou ???????????????????

LAMA2: p.Asp267Asn/p.(Glu1231*) (AR) SeqCap-TR, kazuistika Nemocný syn: SeqCap-TR DNM2: p.Asp215Asn/- (AD) LAMA2: p.Asp267Asn/p.(Glu1231*) (AR) Nemocný otec: DNM2: p.Asp215Asn PCR-sekvenace mutace v genu DNM2 u zdravých dětí z 1. manželství (DNM2: -) LAMA2: p.Asp267Asn Zdravá matka: DNM2: - LAMA2: p.(Glu 1231*)

Autosomálně recesivní NMD u syna i otce SeqCap-TR, kazuistika Nemocný syn: SeqCap-TR DNM2: p.Asp215Asn/- (AD) LAMA2: p.Asp267Asn/p.(Glu1231*) (AR) Nemocný otec: DNM2: p.Asp215Asn PCR-sekvenace mutace v genu DNM2 u zdravých dětí z 1. manželství (DNM2: -) LAMA2: p.Asp267Asn SeqCap-TR: LAMA2: p.Asp267Asn/c.9095dupA Zdravá matka: LAMA2: p.(Glu 1231*) DNM2: - Autosomálně recesivní NMD u syna i otce

Diagnostika neuromuskulárních nemocí 1. Klinická diagnostika 1. Klinická diagnostika Histopatologická analýza svalové tkáně: Enzymová histochemie Immunohistochemická / immunofluorescenční analýza a Western blot Electronová microskopie Molekulárně genetická diagnostika, vyhodnocení kauzality identifikovaných změn Histopatologická analýza svalové tkáně: Enzymová histochemie Immunohistochemická / immunofluorescenční analýza a Western blot Electronová microskopie Molekulárně genetická diagnostika, vyhodnocení kauzality identifikovaných změn