C7900 Lehká biotechnologie 03.4 – Vitamin B12 Petr Zbořil

Vitamin B12 Struktura Část kobaltporfyrinová (korinoidní, faktor B) Část nukleoidová (dimetylbenzimidazol, ribosa, P) Variace Ligandy Adenin místo DBI různě označovány

Vitamin B12 Struktura Část kobaltporfyrinová (korinoidní, faktor B) Část nukleoidová (dimetylbenzimidazol, ribosa, P) Variace Ligandy Adenin místo DBI různě označovány

Vitamin B12 Význam Výskyt – izolace Resorbce – dávkování (ca 1 mg/den) Biochemický – intramolekulární přesmyky, Oxidace MK, methioninový cyklus Fyziologický Perniciozní anemie Řada dalších, Alzheimer, nádorová onemocnění Výskyt – izolace Rybí vnitřnosti, kaly (ČOV), exkrementy přežvýkavcé Fermentační produjce – ca 15 t/rok Resorbce – dávkování (ca 1 mg/den) Potřeba vnitřního faktoru Další přenašeče

Vitamin B12 Resorbce – dávkování (ca 1 mg/den) Potřeba vnitřního faktoru Další přenašeče

Vitamin B12 Vnitřní faktor Glykoprotein produkovaný žaludeční sliznicí 417 AK, 2 domény Komplex s kobalaminem

Vitamin B12 Biosyntéza Není zcela objasněna Porfyrinová část – Gly, succ-CoA – 5-aminolevulinát Množství mikroorganizmů jej syntetizuje (bakterie, aktinomycety), významný výskyt ve výkalech přežvýkavců, aktivovaném kalu ČOV apod. 2 typy B12 – využitelný jen mikroorganizmem, druhý též živočichy

Vitamin B12 Biosyntetické dráhy Několik možností, podle mikroorganizmu Různý výtěžek, zastoupení variant

Vitamin B12 Producenti – jediný způsob výroby 1948 – izolace ze Str. griseus (Rickets a kol.) Stovky fermentačních postupů a modifikací vyzkoušeny Pokusy o izolaci z kalů (USA) Produkce specifická – přímá Řada mikroorganizmů, různé dráhy (syntéza DBI x prekurzor Streptomyces olivaceus, Bacillus megaterium Propionibacterium feudenreichii, P. shermanii Produkce nespecifická – nepřímá Vedlejší produkt při výrobě antibiotik Streptomycety – streptomycin, grisein, aureomycin Genetické modifikace nespecifických producentů Zvýšení produkce kobalaminu při výrobě ATB

Vitamin B12 Důležité podmínky a vlivy Není typický základní substrát (zdroj C) Většinou glukosa, též melasa Zdroj pro růst biomasy i B12, produkce je spojena s růstem Komplexní media Různé složení pro různé producenty Sojová mouka a olej, výpalky, rybí moučka, kasein apod. Další přídavky – anorganické soli – kovy Významná přítomnost Co Obecně vyšší koncentrace inhibují proces Nejlepší organické forma (kvasinky kultivované s Co – extrakt) Dostatečný obsah Co v některých surovinách – melasa, kukuřičný výluh – kontrola, doplnění

Vitamin B12 Důležité podmínky a vlivy – obecně Vzduchování Sterilizace Nezbytné, vliv na kvalitu (mírné, 90 hod. – adenylkobamid, intenzivní, 70 hod. – benzimidazolylkobamid) Asi 0,5 obj./min., nebezpečí pěnění Sterilizace Důležitá, kontaminace sníží výtěžek až na 0,1 mg/L Nežádoucí účinky (vznik inhibitorů?) – výběr vhodného způsobu Cu2+ inhibují (zdroj materiál zařízení), pH  7 sníží jejich produkci Teplota 28 oC (21 – 34) pH Produkce kyselin, pH-stat, ca 7 Vlastní procesy často předmětem utajení

Vitamin B12 Fermentační výroba – Streptomyces olivaceus Propagace 0,5% glukosa, 0,5% (sušina) kukuřičný výluh, 2 ppm CoCl2, 0,1% sojový olej, pH 7,0 Sterilizace 60-90min. Při 120 oC, 48 hod. při 28 oC za třepání Produkce 1% glukosa, 0,9 ppm CoCl2, 2% sojová mouka, 0,1% sojový olej, 0,5% CaCO3, pH 7,0 Inokulum 1 – 5% (malý vliv), vzduchování, kompenzace pH , doba ca 3 - 5 dnů, ca 3mg/L

Vitamin B12 Fermentační výroba – Propionibacterium freundenreichii Fakultativní anaerob Auxotrofie na některé růstové faktory Produkční podmínky Vliv vzduchování – anaerobně produkce pomalá, ale plynulá, aerobní rychlejší, roste pH, pak ubývá produktu a buňky lyzují Pozitivní přídavek laktátu, optimálně s glukosou Symbiosa s mléčnými bakteriemi (L. casei)

Vitamin B12 Fermentační výroba – Propionibacterium freundenreichii Produkční půdy – podle způsobu kultivace Kys. mléčná 2%, glukosa 0,2% - samotné P. f. Laktosa (syrovátka) – P. f. + L. casei, pak 1% kys. mléčné Melasa Ředění, úprava pH 5% kukuřičného extraktu, 10% obilných výpalků Přítokové kvašení Rozkvašení v nízkých koncentracích substrátu Po 48 hod. přídavky kontinuálně nebo dávkami po 12 hod. Využije 2x vyšší koncentraci sacharidu

Vitamin B12 Fermentační výroba – Propionibacterium freundenreichii Přítokové kvašení Rozkvašení v nízkých koncentracích substrátu Po 48 hod. přídavky kontinuálně nebo dávkami po 12 hod. Využije 2x vyšší koncentraci sacharidu Kontinuální fermentace Dvoufázový způsob – dva fermentory Anaerobní – syntéza faktoru B Aerobní fáze – prekurzorování 5,6-dimetylbenzimidazolem

Vitamin B12 Izolace Obecný postup – schéma Ukončení fermentace před rozpadem mycelia a destrukcí Variace dle účelu – léčivo, přísada do krmiva apod. Oddělení mycelia – krmivo, zpracování filtrátu Obecný postup – schéma Uvolnění – reakce s KCN – 1 hod. při 60 – 80 oC Adsorpce – C, bentonit, katex Desorpce – alkoholy, pyridin, vodný roztok NaCN Extrakce – fenol+butanol, CHCl3, krezol Rafinace adsorpční nebo IE chromatografií Zahušťovací kroky, okyselení aj. alternativní operace

Vitamin B12 Izolace – příklad 40 g KCN/100 L media, pH 8, 1 hod., pH 5, 2 hod., var, filtrace přes křemelinu Filtrát + C s křemelinou (2:1), filtrace, koláč promýt 9% fenolem Eluce 60% acetonem, další 90% fenolem, eluáty zahustit Extrakce butanolem s 33% síranu amonného Filtrace přes křemelinu, extrakce zřeď. HCl, pH 3 Zhuštění, extrakce fenol-benzen (1:2), promytí NaHCO3 Srážení aceton+eter (1:20), načervenalá sraženina Rozp. v etanolu, sražení vodou, příp. rekrystalizace z vodného acetonu

Vitamin B12 Děkuji za pozornost