Mikrobiologický ústav uvádí NA STOPĚ PACHATELE Díl druhý: (1) Biochemické identifikační metody (2) Pachatelem je streptokok L Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: zahradnicek@fnusa.cz). K praktickému cvičení pro Bi7170c

Hlavní obsah Identifikační metody Streptokoky Streptokoky – bonusy

IDENTIFI-KAČNÍ METODY

Přehled částí této prezentace Identifikační metody – obecné principy Identifikační metody – problémy & řešení Identifikační metody – praktické postupy (detaily uvnitř) Identifikační metody – jiné než substrátové Novinky v identifikačních metodách Kontrolní otázky

Identifikační metody – obecné principy

Postavení v systému metod Přímé metody (mikrob – část – produkt): Mikroskopie – průkaz ve vzorku i identifikace Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace Biochemická identifikace – jen identifikace! Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku Nepřímé metody (protilátky)

Mezi bakteriemi (i třeba kvasinkami) jsou rozdíly v metabolismu Je velký rozdíl, jestli bakterie provádějí fermentaci nebo aerobní respiraci Je rozdíl, jestli bakterie štěpí spíše bílkoviny a aminokyseliny (například rod Proteus) nebo spíše cukry (například rod Klebsiella) Často je štěpení určitého substrátu znakem adaptace na určité prostředí (dobře adaptované enterobakterie štěpí laktózu, kterou nacházejí v našem střevě)

Obecný princip biochemických testů Bakterie mají svůj specifický metabolismus Průmyslová mikrobiologie využívá bakteriálního metabolismu (zejména fermentativního katabolismu) k výrobě různých látek, včetně řady potravin Klinická mikrobiologie využívá vzájemných rozdílů v metabolismu mezi bakteriemi k jejich vzájemnému rozlišování Zajímají nás přitom mezidruhové rozdíly. Rozdíly mezi různými kmeny stejného druhu jsou spíše na obtíž

Obecný princip II Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt(y). Alespoň jeden produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme vhodný indikátor (buď je v reakci přítomen od počátku, nebo ho přidáme jako činidlo na závěr testu) Existuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. I mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano

Pro připomenutí… Jestlipak víte, že jste se s takovým biochemickým testem už vlastně setkali? Že ne? Ale ano, u kultivace. ENDOVA PŮDA v sobě zahrnuje biochemický test: rozlišuje bakterie na ty, které umějí štěpit laktózu, a ty, které to neumějí. Foto O. Z.

Identifikační metody – problémy a řešení

Problémy Rozdíly jsou i mezi kmeny stejného druhu, nejen mezi druhy Málokdy pozorujeme, že 100 % či 0 % kmenů určitého druhu tvoří daný enzym Častěji je to 90 %, 10 %, 70 %, 30 %… Jak to třeba může vypadat v praxi: Janičkella tvoří lenkulázu v 90 % případů Evičkella tvoří lenkulázu v 10 % případů Lenkuláza-pozitivní mikrob = ??? typická Janičkella ??? atypická Evičkella ???

Problémy – řešení Sledujeme-li jen jeden znak, je velká pravděpodobnost, že narazíme na atypický kmen a identifikace bude chybná Je však velmi malá pravděpodobnost, že by se kmen choval atypicky např. v deseti různých testech najednou Proto čím víc testů, tím větší pravděpodobnost, že se nepleteme Větší počet testů nám zároveň také umožní vzájemně rozlišit více druhů (rodů)

Pravděpodobnost výsledku Jak jsme si řekli, čím více testů použijeme, tím máme lepší šanci, že se nepleteme Přesto tato šance nikdy není celých 100 % Dá se vždy říci například, že náš hypotetický kmen je na 99,3 % Janičkella elegans na 0,5 % Evičkella pulcherima na 0,2 % něco úplně jiného Je pak na zvážení identifikujícího, zda mu taková míra pravděpodobnosti stačí, nebo provede další rozlišující testy

Nejen procento pravděpodobnosti, ale i index typičnosti kmene Ve skutečnosti je výsledek biochemické identifikace zpravidla charakterizován dvěma čísly, nikoli jen jedním: % pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne něco jiného Index typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je Tin = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude Tin nižší než 1,00

Příklady Kmen má identifikaci 99 %, index typičnosti 0,95. Ideální stav, pravděpodobně „je to ono“. Kmen má identifikaci 99 %, ale index typičnosti jen 0,63. Může jít o atypický kmen (je dobré zjistit, který test „mluví proti identifikaci“), ale také o chybu diagnostiky Index typičnosti pro dva taxony vychází shodně 1,00, procento pravděpodobnosti má každý 49,5 % (jedno procento zbývá na „jiné“). To znamená, že je to prakticky určitě jeden z nich, ale bez rozlišujících testů nezjistíme, který to je.

Identifikační metody – praktické provedení

Možnosti praktického provedení Rychlé testy (vteřiny až minuty) Katalázový test Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) Testy s inkubací (hodiny až dny) Jednoduché zkumavkové testy Složité zkumavkové testy Sady jednoduchých zkumavkových testů Testy v plastové destičce (miniaturizace) Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test Testy s diagnostickými proužky (oxidáza a jiné) Jednoduché zkumavkové testy Složité zkumavkové testy Sady zkumavek Testy v plastové destičce

Katalázový test Katalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H2O2) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H2O2  2 H2O + O2 Konkrétní příklady použití tohoto testu medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm

Praktická poznámka Doporučený postup, jak provádět katalázový test, je: na sklíčku vmíchejte trochu hmoty kmene do kapky roztoku peroxidu vodíku Někteří mikrobiologové kapou peroxid přímo na kolonie. V případě krevního agaru je to riskantní – mikrobiolog musí být zkušený, aby odlišil opravdovou katalázovou reakci bakterií od slabé katalázové reakce červených krvinek V praktiku to rozhodně nedělejte i z dalšího důvodu: peroxid bakterie usmrcuje, a na misce by nemuselo zbýt dost živých bakterií pro další studenty.

Testy s diagnostickými proužky Testy s dg. proužky – Reakční ploškou se dotkneme kolonií. V případě pozitivity ploška změní barvu. Nejběžnější jsou tyto: oxidáza – reakční ploška zmodrá (nebo alespoň ta místa, kde jsme se dotkli kolonií). Pro příklady využití tohoto testu klikněte na „“. INAC – reakční ploška po několika minutách zmodrozelená; proužek nutno před použitím navlhčit PYR – reakční ploška po několika minutách, přikápnutí činidla a další minutě čekání zčervená betalaktamázový proužek – týká se testování určitého faktoru rezistence na antibiotika (více v J06)

Provedení testu v praxi Foto: archiv MÚ

Oxidázový test medic.med.uth.tmc.edu/path/oxidase.htm

Jednoduché zkumavkové testy Mohou probíhat v tekuté fázi, nebo v agaru. V obou případech je ve zkumavce substrát, případně také indikátor. Příklady variant postupu jsou uvedeny na dalších obrazovkách

Jednoduché zkumavkové testy – možnosti provedení 1) Substrát je rozpuštěn v tekutině, při testu do něj vmícháme kmen, po inkubaci sledujeme změnu zbarvení (v celém objemu, nebo jako prstenec u hladiny). Příklad: arabinózový test k rozlišení enterokoků (tekutina zůstane zelená = test negativní, Enterococcus faecalis; tekutina zežloutne = test pozitivní, Enterococcus faecium)

Jednoduché zkumavkové testy – pokračování 2) Nejprve rozmícháme v tekutině (fyziologickém roztoku) kmen, pak přidáme proužek (podobný např. oxidázovému) napuštěný substrátem. Substrát se začne uvolňovat z reakční plošky Příklad: ONPG test (pozitivní = tekutina zežloutne, negativní = zůstane bezbarvá), VPT test (po přidání dvou různých činidel se v negativním případě nestane nic, v pozitivním se vytvoří červený prstenec u hladiny)

ONPG ONPG: Příklad jednoduchého zkumavkového testu. Na proužku je přidán substrát. Zežloutnutí tekutiny znamená pozitivitu testu. Příklad použití: rozlišení rodů Citrobacter (pozitivní) a Salmonella (negativní)

Jednoduché zkumavkové testy – pokračování 3) Je připraven agar obsahující substrát. Barva buď zůstane původní, nebo se změní. Příklad: Citrát dle Simmonse. Pokud zůstane půda zelená, je test negativní, pokud zmodrá, je pozitivní medic.med.uth.tmc.edu

Složité zkumavkové testy V jedné zkumavce probíhá více reakcí Např. test MIU. M = motility – pohyb (zákal se rozlézá polotekutým agarem, nezůstává jen v místě vpichu) I = indol (pozitivita = červený prstenec) U = urea (štěpení močoviny indikuje zrůžovění celé půdy) Nebo Hajnova půda

MIU by samozřejmě šlo dělat i jako tři jednotlivé testy: pohyb… www.arches.uga.edu MIU by samozřejmě šlo dělat i jako tři jednotlivé testy: pohyb…

…indol a ureu medic.med.uth.tmc.edu

Hajnova půda (Kligler Iron Agar – KIA v Hajnově modifikaci) Červený vršek – laktóza negativní Žlutý vršek – laktóza pozitivní Červený spodek – glukóza negativní Žlutý spodek – glukóza pozitivní Černý spodek – bakterie tvoří sirovodík (zakrývá pozitivní glukózu!) Potrhání půdy či odsunutí nahoru – bakterie tvoří plyny při fermentaci glukózy www2.ac-lyon.fr/

Příklad vyhodnocení Hajna + MIU Test Hajna MIU Reakce Glc Lac H2S Mot Ind Ure Pseudomonas aeruginosa - (+) Escherichia coli + Proteus mirabilis Salmonella enterica Citrobacter freundi

Sady zkumavek Složité zkumavkové testy mají své nevýhody. Často při pozitivitě jednoho testu není vidět, zda je pozitivní test jiný. Špatně se automatizují a vyžadují dobře zaškoleného pracovníka Jednodušší, i když někdy dražší řešení, je sada několika jednoduchých zkumavkových testů Lze ovšem i zkombinovat testy složité a jednoduché (např. Hajna + MIU + Simmons citrát + ornitin dekarboxyláza – v naší laboratoři)

Miniaturizace: testy v plastových panelech Miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů  testy v důlcích plastových mikrotitračních destiček. Místo každé zkumavky je jeden důlek Počet testů v sadách kolísá od sedmi (Neisseria Test) až po více než padesát Liší se v technických detailech. Vždy je však substrát sušený, bakterie se nejprve rozmíchá ve FR nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků

Provedení testů od firmy Erba Lachema (u nás nejběžnější) Výrobce dodává destičky se sušenými substráty, umístěnými na dně důlků v destičce Pracovník připraví suspenzi bakterie ve FR nebo v suspenzním médiu Do každého důlku se kápne kapka suspenze či dvě kapky Zbytek suspenze se často ještě využije jako zkumavkový test s diagnostickým proužkem (ONPG, VPT) Destička i zkumavka se inkubuje v termostatu

NEFERMtest 24 Erba Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) Foto: O. Z.

Zahraniční soupravy (princip stejný, drobné rozdíly v Zahraniční soupravy (princip stejný, drobné rozdíly v.konkrétním praktickém provedení) www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm. Foto: O. Z. http://www.oxoid.com/bluePress/uk/en/images/PR020505.jpg www.ilexmedical.com/products_engl/api.htm.

www.ucd.ie/kyr/Images/jpgs/Photo16.htm

Vyhodnocení destičkových testů Z takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). Příklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + Je několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“

Možné způsoby hodnocení Porovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. Přepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno Výsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické Počítačové hodnocení se používá hlavně tehdy, pokud už „čtení“ výsledku probíhá automaticky, např. na spektrofotometru.

Oktalové kódy – co to je a proč Matematicky vzato je to vlastně převedení dvojkové soustavy (zápis + + – – + + – – –, respektive 110011000) do osmičkové soustavy (zápis 630) Z praktických důvodů se zpravidla uvnitř trojice sčítá „opačně“ – normálně by při převodu z dvojkové do osmičkové či desítkové soustavy 1 1 0 měla být šestka a 0 1 1 trojka, v praxi to však z jistých důvodů počítáme většinou naopak

Oktalové kódy – II V praxi se tedy každé trojici výsledků přiřadí číslice od nuly po sedmičku – viz následující obrazovka Samozřejmě, pokud má test např. 17 reakcí, je na konci místo trojice jen dvojice, v tom případě číslice na konci může být jen 0, 1, 2, 3. Pokud by reakcí bylo 16 (19, 22…) bude na konci nula nebo jednička.

Praktický příklad Zaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí Pod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4 Sečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“, nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou) Test JAN LEN MAG TOM PET KAR FRA HAN Výsl. + – 1 2 4 Kód 5 3

Přepočítávání trojic – – – 1 2 4 + – – 1 2 4 1 – + – 1 2 4 2 – – – 1 2 4 + – – 1 2 4 1 – + – 1 2 4 2 + + – 1 2 4 1 + 2 3 – – + 1 2 4 4 + – + 1 2 4 1 + 4 5 – + + 1 2 4 2 + 4 6 + + + 1 2 4 1 + 2 + 4 7

Konkrétně u ENTEROtestu16 (17 testů) 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 14 15 16 17 První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l – ? 2 4 3 ONPG

Identifikační metody – jiné než substrátové

Jiné identifikační testy Kromě testů založených přímo na štěpení substrátu, existují i jiné podobné testy, které zkoumají vybavení bakterií určitými enzymy či faktory virulence. Například: Test schopnosti koagulovat králičí plasmu Test schopnosti aglutinovat králičí plasmu Test schopnosti „odpouzdřit“ opouzdřený kmen (hyaluronidázový test) Testování pohyblivosti, to už jsme měli

Plasmakoaguláza a hyaluronidáza (oba testy se užívají u stafylokoků) www.hardydiagnostics.com Foto O. Z. Foto O. Z.

Diagnostické použití antibiotik Jednou z možností je také testování in vitro citlivosti na určité antibiotikum v případě, že víme, že kmen X je ve 100 % citlivý a kmen Y je ve 100 % rezistentní. Ovšem ani tady těch „sto procent“ nebývá stoprocentních… Příkladem je třeba optochinový test Praktické provedení je stejné jako u testů citlivosti na antibiotika

Optochinový test negativní a pozitivní http://www.mc.maricopa.edu

Novinky v identifikačních metodách

Nové identifikační metody Jedním z trendů poslední doby je automatizace biochemické identifikace při zapojení expertního systému. V některých případech identifikace přímo navazuje na (automatickou) kultivaci kmene Problémem při použití těchto metod je, že zpravidla není dostatečně zohledněn klinický původ kmene, a tím vhodná míra přesnosti identifikace, výběr pravděpodobného patogena × náhodně kontaminujícího kmene apod. Jinou možností jsou nové metody na jiném principu, například hmotová spektrometrie typu MALDI-TOF, viz dále

MALDI TOF Princip: hmotnostní spektrometrie již dávno využíváno v chemii, ale klasické způsoby umožňovaly analyzovat látky jen s nízkou molekulovou hmotností založena na rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových hmotností nyní díky ionizaci laserovými paprsky lze detekovat i velké molekuly, charakteristické pro jednotlivé druhy bakterií či kvasinek využívá ionizaci laserem za přítomnosti matrice (MALDI, matrix assisted laser desorption/ionization) v kombinaci s detektorem doby letu (TOF, time-of-flight) prozatím enormní ekonomická náročnost (6 mil. Kč) v Česku zatím jen v Litomyšli (na našem ústavu zapůjčen dodávající firmou v I–III/2011)

MALDI TOF – detaily rychlost částice (nepřímo úměrnou její hmotnosti) lze vypočítat z doby průletu, změřené detektorem (TOF) směs matrice (např. kyseliny 4-hydroxy-skořicové) a kmene na nerezové destičce je zasažena nanosekundovým pulsem laseru matrice absorbuje energii pulsu a molekuly vzorku jsou ionizovány jejím rozkladem metoda u kmene „nalezne“ specifické bílkoviny a porovná je s databází, dnes již poměrně širokou, ale stále rozšiřovanou

MALDI-TOF Přejít na webové stránky výrobce

Práce s MALDI-TOF

Příprava kmene pro MALDI-TOF

Konec http://www.telmeds.org

Příklady použití katalázového testu Nejčastější je použití při diagnostice G+ koků. Z lékařsky významných rodů jsou stafylokoky kataláza +, zatímco stafylokoky a enterokoky kataláza – Nicméně jsou i jiné příklady, například u G+ tyčinek: Listeria je kataláza +, Erysipelothrix (mikroskopicky podobná) kataláza –

Příklady využití oxidázového testu Oxidázu lze využít v různých situacích: Potvrdit určení rodů Neisseria, Moraxella a Pseudomonas (oxidáza pozitivní) Rozlišit mezi Vibrionaceae (oxidáza +) a Enterobacteriaceae (oxidáza – s výjimkou rodu Plesiomonas)

Kontrolní otázky Vyhledejte odpovědi a pak v ISu vyplňte Odpovědník. Znění otázky v Odpovědníku nemusí být zcela identické jako zde. 1. Co znamená zkratka "MIU"? 2. Proč nám ani při rozlišení dvou druhů nemusí stačit jediný test? 3. Jak se používá oxidázový proužek? 4. Jaký je viditelný rozdíl mezi produkty a substrátem v katalázové reakci? 5. Vyjadřuje procento pravděpodobnosti identifikace totéž jako index typičnosti? 6. Když na určité půdě kultivujeme bakterie, získáme informaci, zda fermentují laktózu. Jak se tato půda jmenuje? 7. Kdy není při biochemické identifikační reakci potřeba indikátor 8. Znamená každé využití cukru jeho fermentativní rozštěpení? 9. Je možné, aby jeden druh organismu byl schopen štěpit určitý substrát, a jiný ne? 10. A ještě nějaká překvapení navíc 

STREPTO-KOKY

Přehled streptokoků Příběh Na KA Jméno pachatele 4. viri- dace (alfa) Streptococcus pneumoniae 5. skupina „ústních streptokoků“ 1. (beta) hemo- lýza* Streptococcus pyogenes 2. Streptococcus agalactiae 3. Skupina „non-A-non-B“ streptokoků – žádná Streptokoky bez hemolýzy („gamáči“) *u S. agalactiae jen částečná hemolýza

Přehled témat Klinická charakteristika: Streptokoky s hemolýzou Klinická charakteristika: Streptokoky s viridací Léčba streptokokových onemocnění Diagnostika streptokoků Diferenciální diagnostika streptokoků Pozdní následky streptokokových infekcí

Klinická charakteristika: streptokoky s  (b-)hemolýzou (částečnou či úplnou)

www.rezivo-drevo.cz Příběh první Pan Hmoždinka je kutil. Pracoval v dílně, když se uvolnila těžká fošna se svěrákem a spadla mu na nohu. Vznikla velká tržná rána, navíc znečištěná. Pana Hmoždinku odvezli do nemocnice. Ránu chirurgicky ošetřili, ale objevily se vysoké horečky a příznaky sepse. Při reoperaci byl zjištěn zánět svalových obalů (fascií) s nekrózou. Bohužel, veškerá péče nepomohla: noha nakonec musela být amputována.

http://www.jyi.org/articleimages/463/originals/img0.jpg

Kdo je vinen? Vinen je Streptococcus pyogenes http://www.uni-tuebingen.de Kdo je vinen? Vinen je Streptococcus pyogenes strepto = v řetízcích, pyo-genes = hniso-tvorný Streptococcus pyogenes je známý jako původce angíny (akutní tonsilitidy). Způsobuje ale také hnisavé záněty tkání. Na rozdíl od abscesů, často působených stafylokoky, jde zde spíše o flegmony. Kromě angín má také na svědomí spálové angíny a erysipel – růži. Jde o kmeny produkující tzv. erythrogenní toxin (erythros = řecky červený) Pokud je bakterie sama napadena určitým bakteriofágem, stává se „masožravým streptokokem“ – „meat eating bug“ – náš případ.

Nekrotizující fasciitida Ve skutečnosti je extrémně vzácná. Podmínkou je infekce kmene streptokoka fágem. Infekce uvedené dále jsou mnohem běžnější. http://people.tribe.net

Tonsilitis („angína“): typická nemoc mladých http://www.medicalook.com

Spála (šarlach) http://www1.lf1.cuni.cz Spála = těžká angína + exantém (na kůži) + projevy na sliznici. Streptokok musí produkovat erytrogenní toxin.

Růže (erysipel) www.infektionsnetz.at Je to povrchová infekce kůže, která se charaktericky šíří do kožních lymfatických cév

Růže komplikovaná flegmónou http://www.megru.unizh.ch Další komplikace: Opakovaná růže může poškodit lymfatické cévy a vést k chronickým lymfatickým otokům. http://homepage.univie.ac.at

Příběh druhý Mladá paní E. během těhotenství příliš nedbala na těhotenské prohlídky. V porodnici se objevila až při samotném porodu. Porod proběhl bez komplikací. Brzy se však u dítěte objevily příznaky sepse s respiračním selháním. Včasnou léčbou se podařilo dítě zachránit a také předejít možnému vzniku meningitidy, která v podobných případech bohužel není nijak výjimečná. Později se ukázalo, že paní E. byla nosičkou bakterie, která byla ověřena jako pachatel onemocnění…

http://home.cc.umanitoba.ca/~soninr/Dylan%20in%20hospital.JPG

Kdo za to tentokrát může? I bakterie Streptococcus agalactiae je streptokokem. U člověka se však specializuje spíše na dolní část těla (urogenitální infekce), s možným postižením dítěte při porodu. Bystří studenti si všimnou druhového jména a-galactiae, tedy bez-mléčný. Tato bakterie opravdu způsobuje také záněty mléčné žlázy s poruchou tvorby mléka, avšak většinou je to u krav. Schéma přenosu S. agalactiae u krav (z veterinárního webu) http://www.infocarne.com

http://www.medicalook.com Příběh třetí Klučíka J. škrábe v krku a nelepší se to. Že by angína? Jenže angína je zánět mandlí, a jemu mandle „vyndali“, i ty „nosní“ (adenektomie) a dokonce i ty krční (tonsilektomie). Rodiče s ním zašli k doktorce, ať mu napíše antibiotika. Doktorka ale rozhodla – nejdřív výtěr z krku, a pak se uvidí. Pozvala si J. za tři dny, až už měl výsledek. Nasadila mu penicilin, a ten brzy zabral.

http://www.childrenshospital.org http://www.stronghealth.com

Kdo za to může? Takzvaným „non-A-non-B“ streptokokům tak říkáme proto, že nepatří ani do skupiny A (ve které je Streptococcus pyogenes) ani do skupiny B (kde je S. agalactiae a některé zvířecí streptokoky). Nezpůsobují tak často angíny, ale spíše faryngitidy – záněty hltanu. Často však mohou být přítomny v krku bez klinických potíží. Stejně jako u angín je u citlivých kmenů lékem volby penicilin; makrolidy jen u alergiků.

Klinická charakteristika: streptokoky s viridací (a-hemolýzou)

http://contanatura.net/arquivo/Streptococcus%20pneumoniae.jpg Příběh čtvrtý Paní B., důchodkyně nemá slezinu – vyňali jí ji před léty po autonehodě. Před několika dny začala být „nachlazená“, nevěnovala tomu pozornost, ale teď se její stav zhoršil, takže ji dcera dovezla do nemocnice, kde ji hospitalizovali na infekčním oddělení s podezřením na zánět mozkových blan Díky včasnému nasazení antibiotik se její stav zlepšil a za dva týdny se uzdravila.

Zločincem je v tomto případě Streptococcus pneumoniae, čili „pneumokok“. Dříve se mu říkalo Diplococcus pneumoniae, netvoří totiž řetízky, ale jen dvojice. Také není ideálně kulatý, má spíše lancetovitý (to česky znamená kopíčkovitý) tvar. (To si zapamatujte, examinátory potěší, když to budete vědět. ) V malém množství se nachází i ve farynzích zdravých osob. Jinak je ale původcem zánětů plic, paranasálních dutin středního ucha, a také původcem sepsí a meningitid.

Zdravý bubínek (vlevo), zánět středního ucha (vpravo) www.pedisurg.com

Pneumokoková meningitida http://www.meningitis.com.au http://commons.wikimedia.org

Takhle tento zločinec vypadá www.students.stedwards.edu http://www.cbc.ca/gfx/pix/streptococcus_pneumonia050217.jpg http://www.uni-tuebingen.de http://www.uni-tuebingen.de

http://www.vcu.edu Příběh pátý Pan S. má už dlouho dobu potíže se srdcem, které si dokonce vyžádaly operaci, při které mu byla do srdce voperována umělá srdeční chlopeň. Před měsícem měl ošklivý zubní kaz, a dost dlouho trvalo, než našel čas zajít k zubaři. Nyní se mu zhoršily srdeční potíže natolik, že musel být hospitalizován. Byla stanovena diagnóza endocarditis lenta.

Kdo je tentokrát pachatelem? Ústní streptokoky, viridující streptokoky, alfa streptokoky, v laboratoři dokonce můžete zaslechnout slovo „alfíci“ – všechny tyto pojmy označují skupinu streptokoků, které na krevním agaru viridují; obvykle se ovšem myslí „ty ostatní kromě pneumokoka“. Jsou normální součástí mikroflóry ústní dutiny a částečně i faryngu. I za fyziologických okolností se neustále v malém množství dostávají do krve. Malér je, když se jich tam dostane hodně najednou a když narazí na terén, kde se uchytí.

Vegetace na chlopni http://www.pathguy.com

Postižené srdce http://www.fao.org/docrep/003/t0756e/T0756E83.jpg

Někteří možní pachatelé S. salivarius S. sanguis/sanguinis http://www.osel.cz http://microbewiki.kenyon.edu S. mutans má pravděpodobně ze všech ústních streptokoků největší vztah k zubnímu kazu. S. mutans http://wishart.biology.ualberta.ca

Léčba streptokokových onemocnění

Léčba: spravedlivý trest zločinci Zločinné streptokoky potrestáme vhodným antibiotikem. U streptokoků je stále lékem volby klasický Flemingův penicilin (ať už parenterální G-penicilin nebo perorální V-penicilin). Makrolidy se používají u prokázané alergie na penicilin, mezi léky další volby patří doxycyklin, ko-trimoxazol, ampicilin a další. Vankomycin je rezervní, zatím stoprocentně účinné atb (žádná zóna = chyba, nejde o streptokoka).

Citlivost streptokoků na antibiotika Obrázek demonstruje studii u 1615 branců, provedenou v roce 2003 Jak je vidět, lékem volby u S. pyogenes zůstává penicilin http://www.nhrc.navy.mil

Odečítání in vitro citlivosti Zpravidla odečteme difusní diskový test – změříme zóny a porovnáme s referenčními zónami Opět: horší patogen (pyogenní streptokok) je citlivější než mírnější patogeny Testy jsou provedeny na MH agaru s krvinkami nebo na krevním agaru. Na prostém MH agaru totiž většina streptokoků roste špatně nebo vůbec. Ovšem v diagnostice se to nedá využít, protože některé streptokoky vyrůst mohou!

Referenční zóny nejběžnějších antibiotik Antibiotikum Zkr. „C“ je-li ≥ než (mm) „I“ je-li mezi (mm) „R“ je-li < než (mm) Penicilin P ≥ 18 < 18 Erytromycin (makrolid) E ≥ 21 18–20 Klindamycin (linkosamid) DA ≥ 17 < 17 Chloramfenikol C ≥ 19 < 19 Tetracyklin (tetracyklin) TE ≥ 23 20–22 < 20 Vankomycin (glykopeptid) VA ≥ 13 < 13

Referenční zóny nejběžnějších antibiotik– močové cesty Antibiotikum Zkr. „C“ je-li ≥ než (mm) „I“ je-li mezi (mm) „R“ je-li < než (mm) Penicilin (penicilin) (interpretován jako ampicilin) P ≥ 18 < 18 Tetracyklin (tetracyklin) TE ≥ 23 20–22 < 20 Vankomycin (glykopeptid) VA ≥ 13 < 13 Nitrofurantoin (nitrofuran) F ≥ 17 15–16 < 15

Test citlivosti na streptokoky Antibiotikum Zkratka Referenč. zóna* Penicilin P 18 mm Erytromycin* (makrolid) E 21 mm Clindamycin* (linkosamid) DA 17 mm Chloramfenikol* (amfenikol) C Tetracyklin** (tetracyklin) TE 23 mm Vankomycin (glykopeptid) VA 13 mm Nitrofurantoin*** (nitrofuran) F 15 mm *ne pro IMC **platí i pro doxycyklin ***jen pro IMC (IMC = infekce močových cest)

Diagnostika streptokoků

Popis pachatelů (diagnostika) – 1 Mikroskopie: grampozitivní koky Kultivace: na KA kolonie šedé až bezbarvé, většinou drobné, větší kolonie má Streptococcus agalactiae Hemolytické vlastnosti: některé viridují, některé částečně či úplně hemolyzují Nerostou na KA s 10 % NaCl, ani na Slanetz-Bartleyově či žluč-eskulinové půdě. Jsou však (spolu s enterokoky) rezistentní na aminoglykosidy.

Popis pachatelů (diagnostika) – 2 Biochemické testy: kataláza i oxidáza negativní, biochemicky lze rozlišit jednotlivé druhy zejména u viridujících Antigenní analýza může naopak pomoci spíše u hemolyzujících streptokoků. Používá se systém dle Lancefieldové – teoreticky zahrnuje všechny streptokoky, ale mnohé viridující nedisponují žádným antigenem v tomto systému. Skupiny mají písmena A, B, C, E, F, G a další.

Fotografie z databáze zločinců Zdroj: archiv Mikrobiologického ústavu

Diferenciální diagnostika streptokoků

Odlišení od ostatních podezřelých (diferenciální diagnostika 1) http://memiserf.medmikro.ruhr-uni-bochum.de Gramovo barvení odhalí všechny bakterie, které nepatří mezi grampozitivní koky. Pozitivní kataláza od streptokoků odliší stafylokoky Růst na SB a ŽE půdě odhalí enterokoky, které jsou také všechny pozitivní v takzvaném PYR-testu, kdežto streptokok je pozitivní jen jeden, a to zrovna takový, kterého si málokdo s enterokokem splete (o něm bude řeč dále)

Rozlišení podezřelých streptokoků (diferenciální diagnostika 2) Při rozlišování streptokoků hodnotíme nejdříve hemolýzu – streptokoky členíme na viridující, hemolyzující (částečně či úplně) a ahemolytické Pneumokoka od ostatních viridujících poznáme pomocí pozitivního optochinového testu, testu rozpustnosti ve žluči a dalších S. pyogenes se od ostatních hemolytických pozná pozitivním bacitracinovým a PYR testem S. agalactiae se zase pozná pozitivním CAMP testem – o všech těchto testech viz dále

Schematicky: Neznámá bakterie Jiné G+ kok Streptokok Stafylokok mikroby.blox.pl Schematicky: Neznámá bakterie Jiné G+ kok Streptokok Stafylokok Enterokok Streptokok s viridací Streptokok s hemolýzou Streptokok bez hemolýzy Pneumokok S. pyogenes S. agalactiae (SAG) Ústní streptokok Streptokok non-A-non-B

Pneumokok: jak pojmout podezření Pneumokoka odlišíme optochinovým testem – viz další obrazovka. Podezření však můžeme pojmout, když: mikroskopicky vidíme lancetovité diplokoky kultivačně jsou kolonie ploché, penízkovité až miskovité, někdy s centrálním vyvýšením někdy naopak jsou kolonie výrazné, hlenovité to jsou kmeny s výraznou tvorbou pouzdra (zpravidla velmi virulentní) http://www.cbc.ca

Optochinový test Klasický test k odlišení pneumokoka od ústních streptokoků. Pneumokok je citlivý na antibiotikum optochin, ústní streptokoky jsou rezistentní. (Optochin se dnes už nepoužívá léčebně, zůstal tedy jen v diagnostice) Občas se používá také test rozpustnosti ve žluči. Dnes už historický význam má test patogenity pro myš. http://www.mc.maricopa.edu

Druhové určení ústního streptokoka Jen blázen (nebo badatel) by druhově určoval ústního streptokoka z ústní dutiny nebo krku. Proč to činit, když je v těchto místech běžnou flórou? Na druhou stranu, máme-li kmen z hemokultury či likvoru, je jeho určení na místě. U viridujících streptokoků nemá smysl snažit se o antigenní analýzu, zato, jak jsme se již dozvěděli, velice dobře lze použít biochemické určení. V našich podmínkách je to STREPTOtest 16

STREPTOtest 16 – jak odečíst Tři mušketýři byli čtyři. STREPTOtest 16 (a stejně tak i STAPHYtest 16 a ENTEROtest 16) používá 17 reakcí. První reakcí je opět VPT (D‘Artagnan!) Druhou až devátou reakcí je opět první řádek v dvojřádku Obdobně desátou až sedmnáctou reakcí je druhý řádek v dvojřádku

Příklad výsledku STREPTOtestu 16: Kód 511 420 Streptococcus salivarius % pravd. 97,19 Index typičnosti 1,00 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 14 15 16 17 První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l - ? 2 4 Zkum

Obzvlášť obávaný pachatel: pyogenní streptokok. Jak na něj? PYR test PYR test je provedením podobný oxidázovému. Na kolonie se umístí reakční ploška proužku. Počká se deset minut a přikápne se činidlo. Pozitivní je červené zbarvení. Bacitracinový test byl stejný jako optochinový, jen se použilo jiné antibiotikum. Dnes byl pro menší spolehlivost opuštěn. Foto: archiv Mikrobiologického ústavu

A přichází druhý: Streptococcus agalactiae – 1 Mnohé bakterie tvoří hemolyziny Pokud na agar působí dva hemolyziny, může být jejich působení synergické nebo antagonistické. Příkladem synergismu je CAMP faktor Str. agalactiae a beta lyzin Staphylococcus aureus Nelze jej použít k diagnostice zlatého stafylokoka – ne každý totiž produkuje beta lyzin! Používá se tedy jen v dg. streptokoků

CAMP test Na agar se naočkuje testovaný kmen (S. agalactiae) a kolmo k němu laboratorní kmen zlatého stafylokoka V případě pozitivity vidíme zesílenou hemolýzu ve tvaru dvou trojúhelníků, anebo, poetičtěji, motýlích křídel Foto O. Z.

Hemolytičtí pachatelé – shrnutí Bacitracinový a PYR test CAMP test Streptokok pozitivní negativní* S. pyogenes negativní S. agalactiae non-A-non-B streptokok** ptákovina, špatný test, případně směs dvou kmenů *někdy slabý synergismus, který nemá charakteristický tvar a velikost **v případě potřeby se blíže identifikuje průkazem antigenu

Latexová aglutinace Latexová aglutinace slouží k přesnému určení non-A-non-B streptokoků dle schematu Lancefieldové (nicméně zpravidla stačí určení „je to non-A-non-B streptokok“). Princip ukazuje obrázek. Aglutinace streptokoků s protilátkou je usnadněna díky latexovým částicím http://www.seimc.org

Zapamatujte si: Streptokoky s hemolýzou (úplnou nebo částečnou), ale také streptokoky zcela bez hemolýzy mohou být zpravidla dále určovány latexovou aglutinací (je-li to zapotřebí). Jejich biochemická aktivita je zpravidla chabá. Streptokoky s viridací (alfa-streptokoky) lze zpravidla dále určovat biochemickými testy (je-li to zapotřebí). Jejich antigenní determinanty jsou zpravidla slabé.

Latexová aglutinace – prakticky Praktický test: lahvičky se směsí antibiotik a latexových částic, výsledek (pozitivita v prvním kolečku) http://www.medicine.uiowa.edu http://www.pro-lab.com

Pozdní následky streptokokových infekcí

Streptococcus pyogenes: Už víte, že S. pyogenes způsobuje angíny, spály, erysipel, flegmóny. I po té, co sám zmizí z organismu, může po něm zbýt děsivé dědictví! Protilátky proti němu kolují v krvi… a omylem se místo na streptokoky vážou na některé struktury organismu. Tím vzniká akutní glomerulonefritis či revmatická horečka. Bystří studenti si vzpomněli, že už o tom slyšeli…

Revmatická horečka http://mednote.co.kr

ASLO: způsob, jak zjistit, kolik protilátek vlastně v krvi koluje Pomocí testu ASLO zjistíte, zda je přítomna normální protilátková odpověď, nebo přemrštěná autoimunita s rizikem vývoje glomerulonefritidy nebo revmatické horečky Test ASLO se provádí zpravidla po prodělané streptokokové infekci. Průkazem protilátky se nesnažíme prokázat infekci (o té víme), ale zjistit, zda dochází k vývoji autoimunity. Nejde tedy vlastně o nepřímý průkaz, přestože prokazujeme protilátky.

ASLO: princip (opakování) Protilátka blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. U ASLO neužíváme geometrickou řadu. Hodnoty ředění jsou na lístečku. Titr nad cca 250 znamená možnost autoimunitní odpovědi Všimněte si, že v.angličtině se ASLO označuje jako ASO. Zrada je, že zkratka ASLO přitom také existuje a označuje stafylolyzin.

Jak odečíst panel ASLO Každý pacient jen jeden řádek, hodnoty ředění jsou uvedeny zde: Panel se odečítá naležato. Kromě pacientských sér většinou testuje kontrola.

Nashledanou při dalším dílu! www.giantmicrobes.cz Plyšový streptokok

Bonus 1: Záněty přínosních dutin (sinusitis acuta) Přechodný zánětlivý nález v dutinách je normální při klasické rýmě a není důvodem k léčbě (ani při rtg nálezu) Důvodem k léčbě je bolestivý zánět dutin, který se projevuje bolestí zubů, hlavy, horečkou a trvá aspoň týden, nebo je podrážděný trojklanný nerv (pak ani tak dlouho trvat nemusí Původcem bývá Streptococcus pneumoniae či Haemophilus influenzae

Sinusitis acuta http://www.drgreene.org/body.cfm?xyzpdqabc=0&id=21&action=detail&ref=1285

Výplach dutin: ano či ne? Je zbytečné provádět výplach dutin jen za účelem vyšetření. Zde i mikrobiologové připouštějí empirickou léčbu obvyklých původců Pokud se ale provádí výplach s cílem uvolnění dutiny, je užitečné provést první výplach fyziologickým roztokem a zaslat tekutinu na vyšetření, a teprve další provést např. borovou vodou s cílem desinfekce dutiny Výplach musí být ovšem proveden správně a měl by jej provádět otorhinolaryngolog

Vyšetřování a léčba infekcí přínosních dutin Léčba by měla být zahájena neprodleně, i bez vyšetření. Lékem volby je amoxicilin (např. AMOCLEN), alternativou může být doxycyklin (DOXYBENE), u dětí co-trimoxazol (např. BISEPTOL) Vyšetřovat výtěr z nosu či krku je k ničemu, léčit antibiotiky případného vypěstovaného „patogena“ je přímo chybou.

BONUS 2: Zánět středního ucha – otitis media Častý u dětí (krátká vodorovná Eustach. trubice) Původci: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis U chronických se mohou uplatnit i některé gramnegativní tyčinky Nutno odlišit záněty boltce a zevního zvukovodu: tady je původcem hlavně Staphylococcus aureus (jako u jiných zánětů kůže), léčba lokálně např. framykoin kapky

Otitis media http://www.otol.uic.edu/research/microto/Microtoscopy/acute1.htm http://www.medem.com/MedLB/article_detaillb.cfm?article_ID=ZZZPMV6D1AC&sub_cat=544

Vyšetřování a léčba infekcí středního ucha Léčba má smysl, pokud jde o skutečně prokázaný zánět (bolest, zarudnutí, horečka) a nereaguje na protizánětlivou léčbu Lékem volby je amoxicilin (např. AMOCLEN), alternativou může být co-trimoxazol Vyšetřovat výtěr ze zvukovodu má smysl pouze po provedené paracentéze (propíchnutí bubínku) Jinak má samozřejmě smysl vyšetřit hnisavou tekutinu, která je při paracentéze odebrána

BONUS 3: Infekce hltanu a mandlí (pharyngitis, tonsilopharyngitis) Akutní záněty hltanu a mandlí: většinou virové (rhinoviry, koronaviry, adenoviry, ale i při infekční mononukleóze) Z bakteriálních nejvýznamnější: akutní tonsilitida (povlaková angína) vyvolaná Streptococcus pyogenes (hemolytický streptokok skupiny A) Další bakterie: arkanobakteria, další hemolytické streptokoky, pneumokoky aj. Vzácné, ale důležité: záškrt, kapavka

Virová tonsilopharyngitis http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b1/Pharyngitis.jpg/250px-Pharyngitis.jpg

Tonsilopharyngitis http://medicine.ucsd.edu/Clinicalimg/Head-Pharyngitis.htm http://www.newagebd.com/2005/sep/12/img2.html

Purulentní bakteriální tonsilitis http://www.meddean.luc.edu/lumen/MedEd/medicine/PULMONAR/diseases/pul43b.htm

Vyšetřování a léčba infekcí faryngu Vždy by měl být proveden výtěr z krku (tonsil) pro ověření bakteriálního původu, popř. určení původce. Alternativou je rychlý průkaz streptokoka, ovšem při negativním či sporném výsledku je stejně nutná klasická kultivace Případně se také hodí vyšetření CRP (zvýšený u bakteriálních infekcí) Negativní výsledek kultivace u sexuálně aktivní osoby při zvýšeném CRP – uvažovat též o kapavce (klasický výtěr, ale vyznačit na průvodce)

Léčba tonsilitid a tonsilofaryngitid Léčba by měla být cílená. U angín způsobených Streptococcus pyogenes (a těch je naprostá většina) je lékem volby V-penicilin. Makrolidy (RULID, KLACID, SUMAMED) by se měly používat pouze u alergických pacientů Pokud již saháme po počáteční empirické terapii, měli bychom opět volit V-penicilin, nikoli ampicilin či amoxicilin, a to kvůli vážným komplikacím v případě infekční mononukleózy