Praktikum izolace mikrosatelitů a designování mikrosatelitových primerů Realizace praktika byla umožněna díky finanční podpoře grantem FRVŠ, kategorie F4B, č. projektu 844 Eva Dušková 2009
Přístupy k hledání mikrosatelitů 80/90. léta – štěpení celkové DNA, ligace do vektoru, transformace, detekce hybridizačními sondami PIMA – PCR isolation of microsatellite arrays založená na RAPD konstrukce obohacených knihoven - primerová extense (bakterie s delecí dut a ung genů – ssDNA s U místo T; biotinylované primery)
Přístupy k hledání mikrosatelitů 80/90. léta – štěpení celkové DNA, ligace do vektoru, transformace, detekce hybridizačními sondami PIMA – PCR isolation of microsatellite arrays založená na RAPD konstrukce obohacených knihoven - primerová extense (bakterie s delecí dut a ung genů – ssDNA s U místo T; biotinylované primery) - selektivní hybridizace
Princip metody selektivní hybridizace -FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences COntaining repeats)
1. RESTRIKCE
2. LIGACE – příprava adaptorů 21mer 5´- CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA - 3´ 25-mer 5´- PO4 - TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A - 3´ CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA A CAC GAG AAC GAA TGC GCA CCT GAT - PO4
2. LIGACE
3. PREAMPLIFIKACE 21-mer T A C G T A C G T A C G T A C G T A C G
4. HYBRIDIZACE B B B B B B B B B B B B B B B
5. MAGNETICKÁ SEPARACE B B B B
Bio-Nobile – magnetic pick-pen
6. LIGACE DO VEKTORU
7. TRANSFORMACE
Množství DNA do ligace – insert:vector ration ng vektoru kb insertu kb vektoru insert/vektor molar ratio 17 ng 0,8 kb 3 kb 3 1 Vektor 3 kb 50 ng/l 0,33 l do reakce DNA fragmenty 0,4-1 kb = 13,6 ng 17 ng 0,8 kb 3 kb 1 3 = 1,5 ng
1 2 3 4 8 5 7 6