Poškození DNA vlivem ionizujícího záření

Cíl výzkumu Předmět výzkumu Metoda výzkumu - Vliv ionizujícího záření na DNA Předmět výzkumu - Vznik jednoduchých a dvojných zlomů DNA Metoda výzkumu Cílem výzkumu bylo zjistit, jaký dopad má ionizující záření na strukturu dvoušroubovice DNA - považována za primární terč ionizujícího záření. Zjišťovali jsme počet jednoduchých a dvojných zlomů metodou agarosové elektroforézy. Měření bylo prováděno na různých typech plazmidové DNA ve vodném roztoku. Počet jednoduchých zlomů roste přímo úměrně s dávkou záření. Výskyt dvojných zlomů není v rozsahu použitých dávek významný. Vzorky byly vyhodnocovány pomocí softwaru ImageQuant. - Agarosová elektroforéza

Struktura DNA DNA - nositelka genetické informace Stavební kámen – nukleotid Primární struktura – pořadí bází Sekundární struktura - dvoušroubovice DNA: -jedinečnou nositelkou genetické informace o struktuře a funkci buňky Základním stavebním kamenem DNA je tzv. nukleotid, který se skládá z fosforečného zbytku, pětiuhlíkového cukru deoxyribóza a purinové (A - adenin a G - Guanin) nebo pyrimidinové dusíkaté báze (T - thymin a C - cytosin). DNA se v organismu uchovává ve formě pravotočivé dvoušroubovice, ve které se nacházejí dva proti sobě jdoucí řetězce nukleotidů.

Změny struktury DNA vlivem ionizujícího záření - přímo - nepřímo zlomy řetězce (jednuduché - SSB, dvojité - DSB) - v organismech dochází k obnovení Ke změnám dochází vlivem ion. Záření. Ionizujícím zářením nazýváme takové záření, které je schopno vyrážet elektrony z atomového obalu a tím látku ionizovat. Ionizující záření poškozuje DNA buď přímo, tj. interakcí ionizující částice s atomem molekuly DNA, nebo nepřímo prostřednictvím  produktů radiolýzy vody. Výsledkem je především produkce zlomů řetězce (jednoduchých i dvojitých), vznikají však také např. poškození bází a další poškození. Nepoškozený plazmid se nachází ve smotané (supercoiled) formě. Jestliže dojde účinkem ionizujícího záření ke zlomu jednoho řetězce (tzv. single strand break - SSB), plazmid relaxuje do kruhové formy Pokud dojde ke zlomu obou řetězců (double strand break – DSB), vznikne lineární forma plazmidu - protože molekula se snaží zaujmout pozici s nejmenší potenciální energií Proto její poškození může mít vážné důsledky na celý organismus. Obnovení struktury a funkce DNA v biologických systémech po ozáření je pro organizmy jedním ze základních a nenahraditelných mechanizmů [1]. Terciální struktura Sekundární struktura

Materiály plazmid typu pcDNA3 a pBS složení vzorku : - DNA - pufr - voda - fluorescenční barvivo Vzorky obsahovaly 100 ng DNA v 10 mM fosfátovém pufru a konečný objem vzorku byl 10 l. DNA bakterie Escherichia coli.

Postup příprava agarosového gelu příprava vzorku ozáření vzorku DNA deponování vzorku do gelu migrace vzorku v elektrickém poli detekce DNA pomocí UV záření Softwarové zpracování výsledné fotografie

Příprava agarosového gelu 0,8 % agarosový gel s fluorescenčním barvivem Sybr Green I a byl použit pufr TAE, nalití gelu do formy a vložení hřebínku, nechat zatuhnout po celou dobu ozařování vzorků.......

Příprava vzorku V tubách Eppendorf o objemu 1,5 ml, vzorky obsahovaly 100 ng DNA v 10 mM fosfátovém pufru a konečný objem vzorku byl 10 l. Pipetou deponováno do tub.....................................

Ozáření vzorku DNA Doba ozáření zhruba 20 minut,Ozařování probíhalo na zdroji 60Co o dávkovém příkonu 3,2 mGy/s

Deponování vzorku do gelu Ozářené vzorky byly deponovány pipetou do 0,8 % agarosového gelu s fluorescenčním barvivem. Metoda agarosové elektroforézy umožňuje odseparovat tři formy DNA, neboť v gelu migrují různou rychlostí

Migrace vzorku v elektrickém poli DNA je záporně nabito,kvůli fosfátu, migrují ke kladnému pólu,pohybují se gelem............

Detekce DNA pomocí UV záření Gel byl umístěn pod UV lampu a vyfotografován přes želatinový filtr

Softwarové zpracování výsledné fotografie Procentuální zastoupení jednotlivých forem DNA bylo kvantifikováno pomocí softwaru ImageQuant.

Výsledky měření (pcDNA3 ) Bylo ověřeno, že s rostoucí dávkou roste výtěžek jednoduchých a dvojtých zlomů. V grafu je vynesen počet SSB a DSB na plazmid při ozařování pcDNA3 Zatímco počet jednoduchých zlomů lineárně roste, výskyt DSB není v rozsahu použitých dávek významný. Zezhora: Jednoduchý zlom - cyklická Dvojný zlom – lineární neporušená

Výsledky měření (pBS) Nárůst počtu jednoduchých zlomů s dávkou jsme pozoroval také pro plazmid pBS. Počet dvojných zlomů zůstává v rozsahu použitých dávek velmi nízký. Je to způsobeno tím, že původní plazmid se nacházel v roztoku s vysokou koncentrací tzv. scavengerů, což jsou látky, které jsou schopny vychytávat radikály vzniklé při radiolýze vody. Zezhora Jednoduché neoporušené

Výsledky měření (pBS ve vodě) Když byl ozářen plazmid pBS původně rozpuštěný ve vodě již při dávce 15 Gy byla všechna DNA poškozena (1, 2) a od dávky 45 Gy byla již tak fragmentována, že nebyla pozorovatelná. (barvivo se nemé kam navázat) Zezhora: Dvojné Jednoduché nepškozené

Rychlost migrace Rychlost migrace závisí na velikosti plazmidu resp. Počtu bází Z leva: pcDNA3 – 5.400 bází pBS – 3.500 bází

Zhodnocení lineární růst poškození jednoduchých zlomů velmi nízký počet dvojných zlomů některé typy velmi náchylné (např. pBS)

Poděkování Ústavu jaderné fyziky AV ČR, Oddělení dozimetrie záření Viktorii Štísové Vojtěchu Svobodovi FJFI ČVUT Ústavu jaderné fyziky AV ČR, Oddělení dozimetrie záření za poskytnutí prostorů, techniky a materiálu ke studiu, Viktorii Štísové za objasnění problému a pomoc při realizaci, FJFI ČVUT za poskytnutí prostředků a organizaci.